纳米ZnO对斑马鱼肝和鳃组织结构的影响【开题报告+文献综述+毕业设计】 23页

本科毕业论文系列开题报告生物技术纳米ZnO对斑马鱼肝和鳃组织结构的影响一、选题的背景与意义正如20世纪微米科技给人类带来的进步一样，纳米科技也将导致人类未来生产和生活方式的革命性变化。就在人们逐渐认识纳米科学技术的优点和其潜在的巨大市场的同时纳米生物效应与安全性，即纳米生物环境安全性问题，引起了科学界和各国政府的高度重视。纳米氧化物，如纳米ZnO、纳米TiO2、纳米SiO2等，已被广泛应用于生产和生活中．这些纳米氧化物有可能通过城市废水等途径释放到水环境，其对水生生物的影响不容忽视．目前，关于纳米TiO2的水生毒性报道较多，纳米TiO2能够引起鱼类腮和肠等器官发生病理学改变和氧化损伤，抑制绿藻和大型蚤繁殖，抑制细菌生长。而对于纳米ZnO的水生毒性报道较少，如纳米ZnO能够破坏E．coli细胞的三层膜结构，导致膜渗透性增强，从而引起纳米ZnO在细菌细胞膜上聚集，并进入细胞内部。但纳米ZnO对斑马鱼等水生模式生物研究报道较少，所以本项目选择纳米ZnO对斑马鱼组织结构的影响试验，从生理结构方面观察、解释纳米ZnO对水生生物产生的影响。斑马鱼是一种小型热带淡水鱼，生存能力强，遗传背景清楚，物种稳定，繁殖力强，胚胎透明，易于观察，基于自身的这些优点最早是作为胚胎发育生物学和遗传学的实验动物模型。自20世纪70年代末期，国外开始运用斑马鱼进行化学物的急性毒性研究，现在斑马鱼(Brachydaniorerio)是国际标准化组织（ISO）推荐使用的标准化鱼类毒性试验动物。本课题正是基于这一点，选取斑马鱼作为实验动物，研究纳米二氧化钛是否会对斑马鱼的组织结构产生影响，为该领域的研究积累一定的资料。二、研究的基本内容与拟解决的主要问题： （一）基本内容（1）鱼的驯养：用于实验的斑马鱼，实验前必须对实验条件，如水温、硬度、盐度等进行驯化，使之适应实验条件。驯养时间为一个星期。（2）慢性毒性实验：实验设置处理组和对照组。每组放入20尾斑马鱼，每天观察记录各实验组的摄食、行为以及死亡情况，一个月后，每组各5尾鱼，取所需要的材料——斑马鱼的腮及其肝脏组织，进行石蜡切片的制作。最后显微观察（二）拟解决的主要问题：石蜡切片的制作是关键的步骤。（1）取材：斑马鱼的肝脏较小，取的过程中要小心细心还有快速。（2）脱水：脱水过程要注意时间的确定，低醇中停留不宜太长，太久会使组织变软，助长材料解体；高醇中，停留也不宜过久，否则会使组织变脆，影响切片。时间比较难控制。（3）透明：更换透明剂动作迅速，要使材料不干涸，同时要避免吸收湿气。（4）染色及分化：染色时间颖根据染色剂的成熟程度及室温高低，要适当缩短与延长。高温时促进染色，时间可短些。冬季室温低时可放入恒温箱中染色。分化的过程是染色成败的关键，分化不当会导致染色不均，或深或浅，得到的切片染色效果差。驯化，染毒二、研究的方法与技术路线：取材肝腮Bouin固定Bouin固定脱水、透明包埋脱水、透明包埋切片展片切片展片染片封片染片封片 观察二、研究的总体安排与进度：2010.9~2010.10查阅文献、资料，准备实验中要用的材料和仪器。2010.10~2012.2进行实验和外文文献的翻译。2011.3~论文撰写五、主要参考文献：[1]吴玲玲,陈玲,张亚雷，等.菲对斑马鱼鳃和肝组织结构的影响[J].生态学杂志,2007,5:688~692.[2]刘红云,白伟,张智勇,等.纳米氧化物对斑马鱼胚胎孵化率的影响[J].中国环境科学,2009,1:53～57.[3]朱小山,朱琳,田胜艳,等.三种金属氧化物纳米颗粒的水生态毒性[J].生态学报，2008,8:3507~3516.[4]XiaoshanZhu，LinZhu，YongshengChen，etal.AcutetoxicitiesofsixmanufacturednanomaterialsuspensionstoDaphniamagna[J].NanopartRes，2009,11:67~75.[5]RobertJ.Griffitt.RoxanaW.ExposuretoCopperNanoparticlesCausesGillInjuryandAcuteLethalityinZebrafish(Daniorerio).EnviromentalScienceTechnology,2007,9:967~976.[6]汤宏波.纳米材料在生态环境方面的应用及潜在危害[J].前沿,2008,3:51～55.[7]金一和,孙鹏,张颖花.纳米材料对人体的潜在性影响问题[J].自然杂志,2001,5:306～307.[8]吴玲玲,陈玲,张亚雷,等.菲对斑马鱼鳃和肝组织结构的影响[J].生态学杂志,2007,5:688～692.[9]张学治,孙红文,张稚妍,等.鲤鱼对纳米二氧化钛的生物富集[J].环境科学,2006,8:1631～1635.[10]刘昌盛,穆宇,杜久林,等.斑马鱼在生命科学研究中的应用[J].生命科学,2007,4:382～386.[11]刘扬,高愈希,吴刚,等.典型纳米材料生物效应及其毒理学研究的进展[J].中华预防医学杂志,2007,3:130~133.[12]王娜，程炯佳，金焰,等.人工纳米材料的生物效应及其对生态环境的影响[J].生态毒理学报,2007,9:252~264.[13]朱小山，朱琳.人工纳米材料生物效应研究进展[J].安全与环境学,2005,8:86~90. [14]田文静,白伟,赵春禄，等.纳米ZnO对斑马鱼胚胎抗氧化酶系统的影响[J].中国环境科学,2010,5:705～709.[15]刘红云,白伟,张智勇,等.纳米氧化物对斑马鱼胚胎孵化率的影响[J].中国环境科学,2009,1：53～57.[16]王琳,王莉娟,张芳,等.纳米氧化锌对人肺腺癌细胞A549的毒性[J]中国科学院研究生院学报,2009,1：83~89.[17]宋文华,刘艳,高敏苓,等.纳米ZnO对大型溞的急性毒性效应研究[J].天津师范大学学报,2009,7:51~54.[18]MargitHeinlaan,AngelaIvask,IrinaBlinova,etal.ToxicityofnanosizedandbulkZnO,CuOandTiO2tobacteriaVibriofischeriandcrustaceansDaphniamagnaandThamnocephalusplatyurus[J].elsevier.2008:1308~1316.[19]李秀梅.纳米氧化锌的性质和用途[J].通化师范学院学报,2004,4:54~56.[20]袁金华,李光,陈慧珍,等.纳米氧化锌对人胚肺成纤维细胞的生物毒性[J].中山大学学报,2009,3:170~178.[21]郭利利,刘晓慧,秦定霞,等.纳米ZnO对雄性小鼠的体内作用及对生殖系统的影响[J].医学研究生学报,2010,4:257~264. 毕业论文文献综述生物技术纳米ZnO生物效应的研究进展摘要：随着纳米技术的迅猛发展，纳米材料越来越广泛地应用于社会科技生活的各个领域，在给人们生活带来便利的同时，纳米毒性也日益受到越来越广泛的关注。然而目前纳米毒性关注的焦点多集中在碳纳米管等早先发现的纳米材料上，却对纳米ZnO这一取得方便、制备容易、应用广泛、的纳米材料关注不足。本文从细胞水平和在体水平综述了纳米ZnO毒性研究进展，阐述了纳米ZnO：对人体及其它生物潜在的生物效应，并提出对纳米ZnO进行安全性评估的必要性。关键词:纳米技术；纳米材料；纳米ZnO；生物效应1概述纳米材料是指几何尺寸达到纳米级水平且具有特殊性能的材料。当物质小到1～100nm(10-9~10-7m)时，由于量子效应、局域性及巨大的表面与界面效应，使物质的一些性质、性能发生了质变，原子、分子水平上制造的纳米材料和器件在化学、材料、生物、医学等领域有着广泛的应用，引发了一场“新的工业革命”[1]。随着纳米材料的广泛运用潜在的负面影响也已引起人们的广泛关注。2003~2004年，Science等先后发表文章讨论纳米材料与生物环境相互作用可能产生的生物效应问题[2]。美国化学会以及欧洲许多学术杂志也纷纷对纳米生物环境效应问题进行调研。该报告建议英国政府成立专门研究纳米生物环境效应与安全性的研究中心[3]。2004年，欧共体在布鲁塞尔公布了“欧洲纳米战略”，把研究纳米生物环境健康效应问题列在欧洲纳米发展战略的第三位。同时，欧洲宣布启动“NanosafetIntegrairngProjects”计划，全面开展纳米生物效应与安全性的研究[2]。2001年，中国科学院高能物理研究所提出“开展纳米生物效应、毒性与安全性研究”[3]，2004年对原有的纳米生物、稀土金属与重金属毒理和有机卤素的生物效应与毒理学研究组进行整合，成立了“纳米生物效应实验室”，与国内外有关研究组织合作，系统开展纳米物质生物效应的研究，已获得了一批研究成果[3]。目前，国内研究重点是纳米物质整体生物学效应以及对生理功能的影响、纳米物质的细胞生物学效应及其机制以及大气纳米颗粒对人体作用和影响等领域的研究。2纳米氧化锌简介纳米氧化锌是粒径介于1～100nm 的微粒。由于颗粒尺寸的细微化，比表面积急剧增加，使得纳米氧化锌产生了其传统氧化锌块体材料所不具有的表面效应、小尺寸效应和宏观量子隧道效应，因而纳米氧化锌在磁、光、电、热、敏感等方面有一般氧化锌产品无法比拟的特殊性能，具有一系列优异的物理、化学性能，在精细陶瓷、紫外线屏蔽、压电材料、光电材料、高效催化材料、磁性材料等方面具有广阔的应用开发前景[4~5]。纳米ZnO已广泛应用于各个领域，有可能通过不同的途径进入人体，如在生产和使用过程中直接进人人体，通过食物链、环境进入人体[6]。3纳米氧化锌的生物效应3.1纳米氧化锌对肺组织的伤害作用临床实验研究发现7～100nm的粉粒在人体呼吸系统内有很高的沉积率；粉粒越小、越难以被巨噬细胞清除，而容易向肺组织以外的组织器官转运，超细粉粒可穿过血脑屏障[7]。王琳等[8]研究了纳米氧化锌对体外培养的人肺腺癌细胞A549的生物学效应．使用0mmol／L、0．1mmol／L、0．5mmol／L、1mmol／L、5mmol／L、l0mmol／L的纳米ZnO处理体外培养的人肺腺癌A549细胞，细胞实验结果表明，纳米znO颗粒对A549细胞的生长活性具有明显的抑制作用，存在剂量-效应关系．纳米氧化锌诱导人肺腺癌A549细胞产生活性氧，引发细胞凋亡，并产生细胞毒性。袁金华等[9]在研究化妆品添加剂——氧化锌纳米粒子对正常人胚肺成纤维细胞(HELF)的生物毒性的试验中发现在测试的2．5～150mg/L浓度范围内，氧化锌纳米粒子对HELF细胞均有抑制作用，细胞毒性呈明显的剂量依赖效应关系。浓度在20mg/L以上时，氧化锌纳米粒子可致使细胞生存率低于10％。荧光显微镜可见典型的细胞凋亡改变。扫描电子显微镜观察到HELF细胞表面与高浓度纳米粒子作用后产生的纳米级孔。纳米氧化锌粒子由于小尺寸效应和Zn2+自身毒性的协同作用，高浓度时抑制细胞结活性，致使细胞死亡。3.2纳米氧化锌对其他器官的影响纳米能损伤心脏、肝脏和肾脏。郭利利等[10]在研究纳米ZnO对雄性小鼠的体内作用及对生殖系统的影响时发现纳米ZnO对小鼠的肝、肾和心功能有影响，并影响活精子率和精子畸形率；在500mg／kg纳米ZnO对小鼠的肝、肾和心功能有明显影响，影响小鼠精子数量和质量，诱导睾丸生精细胞的凋亡。吴诚等[11]测定纳米氧化锌对小白鼠的急性毒力高剂量纳米氧化锌可对小鼠的肾脏、小肠、肺脏和肝脏等组织器官造成广泛性损伤，并引起严重的瘀血、出血、细胞变性坏死、大量细胞核固缩碎裂等病理变化。有文献报道与纳米SiO、TiO等材料相比，纳米ZnO具有很强的细胞毒性[12]。3.3纳米锌在动物体内的转移 纳米材料由于其微小的粒径和独特的性质，具有比其他材料和大颗粒物质更大的在生物体内迁移的可能性[13]。Oberdǒrster[14]等人首次证实，纳米颗粒能从肺组织绕过血脑屏障向脑组织迁移。其他学者则发现，沉积在肺组织的纳米颗粒会有极小部分转移到血液或其他器官中。3.4皮肤对纳米锌的吸收皮肤对MNMs的吸收主要来自化妆品、防晒剂的使用，也包括某些药物治疗[15]。防晒剂含有TiO2和ZnO纳米颗粒，粒径范围在20～100nm问，被吸入皮肤后产生氢氧自由基的风险上升，并可能导致氧化伤害和DNA损伤[16]。这一结论目前仍有争议。3.5对水生生物的毒性研究纳米ZnO具有水生急性毒性。朱小山等[17]在三种金属氧化物纳米颗粒的水生态毒性的结果显示nZnO、nTiO2，和nAl2O3水悬浮液均能抑制斜生栅藻的生长，抑制大型蚤的活动，并导致大型蚤死亡。nZnO的毒性相对最大，对藻类有毒，对大型蚤为剧毒。刘红云等[18]纳米ZnO对斑马鱼胚胎孵化抑制作用明显，毒性较大，且其毒性与浓度之间存在一定的剂量一效应关系；在低浓度时，纳米ZnO抑制胚胎孵化的效应较等浓度Zn2+强，说明纳米ZnO特殊理化性质发挥了一定作用。李小云等[19]实验纳米ZnO可以在鱼体内富集。颗粒态锌在鱼鳃和鱼肉中的积累，颗粒态锌在鱼鳃和鱼肉的积累都随锌浓度的升高而升高，颗粒态鱼鳃积累尤其大于鱼肉，其他形式进入鳃组织，再转移到血液的浓度梯度驱动的被动扩散过程。4纳米材料生物效应可能的作用机制纳米颗粒对生物系统的影响是巨大的也是全方位的，可以进入机体中枢神经系统和心脏等重要组织[20]，已有文章综述了纳米颗粒对人类健康的影响包括进入人体的途径、主要的作用器官以及引发的健康问题。国内外许多研究组的研究都表明：纳米粒子的尺寸不同所产生的生物效应也不同[21]。锌颗粒(58±16nm和1．08±0．25nm)对小鼠的急性毒性研究表明：1次性经口染毒(5g／kg体重)时，纳米锌组对小鼠的肝、肾、心功能有损伤，并有胃肠道反应(如：无力、腹泻、呕吐等)，1周内纳米锌组小鼠死亡率为10％；微米锌虽然也出现了某些异常表现，但比相同剂量的纳米锌颗粒引起的异常反应症状少、程度轻且无死亡[22]。根据目前的研究[23]，超细材料导致肺组织炎症的细胞及分子学机制的假设为：颗粒对细胞产氧化胁迫，导致脂质过氧化产物如4-hydmxynonenal的生成和氧化型谷胱甘肽(GSSG)的产生。细胞内氧化还原平衡遭到破坏，从而导致致炎作用。而且，氧化胁迫或者直接与颗粒的相互作用都能刺激细胞溶质Ca2+浓度的上升，这也会导致发生炎症及抗氧化产物(如 GSSG等)含量上升。另外，MNMs导致肺组织伤害的免疫学机制可能和巨噬细胞有关[24]。如SWCNTs和CB都被肺泡巨噬细胞吸收，但是它们在肺组织中的趋归和反应却不同[25]。装满CB的巨噬细胞散布在肺泡空间中，而装满SWCNTs的巨噬细胞却快速移动到肺小叶中央位置，在那里进入肺泡隔膜并聚集，从而导致上皮状肉芽瘤的生成。5展望到目前为止尚未出现纳米ZnO对环境或人体安全性产生污染或致命的毒效应的报导，但纳米ZnO的生物安全性问题已引起各个领域专家学者的广泛讨论和研究。宏观物质的安全性评价已不适用于评估纳米ZnO：，在完善纳米ZnO毒性和化学特征数据的基础上建立纳米ZnO：安全性评估体系是非常有必要的。纳米ZnO：颗粒的亲疏水性、表面电荷和粒径、纳米颗粒表面修饰等都会改变其与生物体的相互作用，改变这些因素就可以调控纳米ZnO的生物毒理学行为，甚至可以消除纳米ZnO的毒性。只有通过大量的研究，获得充足的毒理学数据，才能正确评价其毒性。参考文献[1]刘扬,高愈希,吴刚,等.典型纳米材料生物效应及其毒理学研究的进展[J].中华预防医学杂志2007,2:130~133.[2]骆蓉芳,倪士峰,刘惠纳.米材料的生物效应研究进展[J].北药学杂志,2010,2:72~74.[3]韦东远,鲍志敏,董晓玲.关于世界纳米材料生物效应与安全性研究的思考[J].中国科技论坛，2007,7：112~116．[4]沈毅,沈上越,李珍纳.纳米氧化锌的制备及应用[J].材料导报，2004,10:137~139[5]贾漫珂,王俊,郑思静,等．纳米氧化锌的制备新方法[J]．武汉大学学报，2002,4:420~425.[6]陈海群,汪冰,王凯全.纳米材料对生物体的毒性研究[J].中国安全科学学报,2010,1:106~111.[7]赵宇亮,白春礼.纳米安全性:纳米材料的生物效应[M]．北京：科学出版社，2005：137~142.[8]王琳,王莉娟,张芳,等.纳米氧化锌对人肺腺癌细胞A549的毒性[J].中国科学院研究生院学报,2009,1:84~89.[9]袁金华,李光,陈慧珍,等.纳米氧化锌对人胚肺成纤维细胞的生物毒性[J].中山大学学报,2009,3:170~178.[10]郭利利,刘晓慧,秦定霞,等.纳米ZnO对雄性小鼠的体内作用及对生殖系统的影响[J]. 医学研究生学报,2010,4:357~364.[11]吴诚,文利新,袁慧,等.纳米氧化锌对小鼠的毒性试验[J].粮食与饲料工业,2008,5:38~39.[12]SotoKF,CarrascoA,PowellTG,eta1.Comparativeinvitrocytotoxicityassessmentofsomemanufacturednanoparticulatematerialscharacterizedbytransmissionelectronmicroscopy[J].NanoparticleRes,2005,7:145-169.[13]朱小山,朱琳.人工纳米材料生物效应研究进展[J].安全与环境学报,2005,8:86~90.[14]0berdorsterG,SharpZ,AtudoreiV,eta1.Translocationofinhaledultratfineparticlestothebrain[J].InhalationToxicology,2004,6:437～446.[15]Vicki,Colvin.Thepotentialenvironmentalimpactofengineerednanomaterials[J]．NatureBiotechnology,2003,10:1166～1170.[16]厚瑞萍,刘荚超,邓春晖,等.金属氧化物在磷酸化蛋白质组学研究中的应用[J].生物技术,2009,6,485~488.[17]朱小山,朱琳,田胜艳,等.三种金属氧化物纳米颗粒的水生态毒性[J].生态学报,2008,8:3507~3516.[18]刘红云，白伟，张智勇，等.纳米氧化物对斑马鱼胚胎孵化率的影响[J].中国环境科学,2009,1:53～57.[19]李小云，王丽萍.重金属锌在鱼鳃和鱼肉中的积累[J].光谱实验室,20093:265~268[20]王天成，汪冰，丰伟悦,等.纳米锌粉对小鼠血常规和凝血指标的影响[J].中国工业医学杂志,2006.10:267~274.[21]孙勇,李华佳,辛志宏,等.纳米食品的活性与安全性研究.食品科学,2006,9:936~939.[22]WangB,FengWY,WangTC,eta1.Acutetoxicityofnanoandmicro-scalezinepowderinhealthyadultmice.ToxicolLett.2006.1:l15~123.[23]DonaldsonK,StoneV.CurrenthypothesesonthemechnaismsofToxicityofuhrafineparticles[J].AnnistSuperSanit,2003,3:405～410.[24]朱小山,朱琳.人工纳米材料生物效应研究进展[J].安全与环境学报,2005,8:86~90.[25]ChiuWingLain,JamesJT,RichardMcCluskey,eta1.Pulmonarytoxicityofsingle-wallcarbonnanotubesinMice7and90daysafterjntratrachealinstillationl[J].ToxicologicalSciences,2004,1:126～134. 本科毕业设计（20__届）纳米ZnO对斑马鱼肝和鳃组织结构的影响 目录摘要（Abstract）1引言21.1概述21.2纳米氧化锌简介21.3研究现状21.4研究目的32材料和方法..............................................................................................................................32.1试验材料32.1.1试验动物32.1.1试剂和仪器32.2慢性毒性试验32.2.1染毒条件32.2.2样品制备43结果43.1行为观察43.2对照组鱼的鳃结构43.3处理组鱼的鳃结构变化43.4肝结构变化54讨论64.1纳米氧化锌斑马鱼鳃结构的影响64.2纳米氧化锌斑马鱼肝结构的影响74.3纳米氧化锌对斑马鱼的毒性机理75总结8致谢9参考文献10附录11 摘要:采用浓度为0、1.00、5.60、11.20mg·L-1的纳米ZnO悬浮液对斑马鱼(Brachydaniorerio)进行30d的暴露实验，研究了纳米ZnO对斑马鱼鳃、肝结构的影响。H-E染色显示：在1.00mg·L-1的纳米ZnO悬浮液暴露下，受试鱼未发现有受到毒性作用；在5.60mg·L-1的纳米ZnO悬浮液暴露下，受试鱼的鳃受到损伤，受试鱼还发生鳃丝上皮增厚、鳃小片上皮隆起现象，在11.20mg·L-1鳃小片明显的出现水肿，此外，较高浓度的纳米ZnO悬浮液暴露会造成斑马鱼的肝组织损伤，5.60mg·L-1的纳米ZnO悬浮液暴露下，受试鱼的肝细胞发生肿大，胞质产生空泡，肝细胞变得不规则，细胞核萎缩变形和偏离细胞中心，11.20mg·L-1的纳米ZnO悬浮液暴露下部分肝细胞空泡化程度加重，发生核溶解或细胞溶解，造成局部肝组织坏死。表明水环境中纳米ZnO悬浮液浓度达到1.00mg·L-1未发现对斑马鱼的鳃、肝产生毒性作用；而纳米ZnO悬浮液浓度达到5.60和11.20mg·L-1时，受试鱼的鳃、肝将受到较严重的损伤；伴随纳米ZnO悬浮液浓度的升高，鱼的鳃、肝损伤加重。关键词:纳米氧化锌；斑马鱼；肝；鳃；生物毒性ABSTRACT:Inthisstudy,BrachydanioreriowasexposedtothreeconcentrationsofnZnO(0,1.0and5.60mg·L-1)for30days,andthehistopathologicaleffectsofnZnOonB．reriogillandliverwereexaminedunderlightmicroscope.Theresultsshowedthatat1.0mg·L-1ofnZnO,therehavenotfoundanyeffectonB．rerio.Butat5.6mg·L-1ofnZnO,themostcommonchangesofB．reriogillwereepithelialhypertrophy,besideat11.20mg·L-1ofnZnOgilllamellaeobviousedema.Thethickeningoffilamentepitheliumandtheliftingoflamellarepitheliumweretheotherhistopathologicaleffectsof5.6mg·L-1nZnO.Inaddition,thehigherconcentrationofnano-ZnOsuspensionsexposurecancauseliverdamageinzebrafish.Afterexposureto5.6mg·L-1nano-ZnOfor30days,theshapeofhepatocyteswasirregular,somenucleiwereatrophyanddeformationorinalateralpositionclosetothecellmembrane,andat11.20mg·L-1ofnZnO,hepatocyteswerehighlyvacuolated,andfocalnecrosisoccurredaftercytolysisandkaryolysis.1.0mg·L-1ofnZnOhasnotfoundtoxiceffectonB．reriogillandliver.But thedamagewasfoundwhenexposedto5.60and11.20mg·L-1ofnZnO.TheimpairmentofB．reriogillandliverwasincreasedwithincreasingphenanthreneconcentration．KEYWORDS:nZnO;Brachydaniorerio;gill;Liver;toxicefect.1引言1.1概述纳米材料是指粒子尺度为纳米级水平且具有特殊性能的材料。当物质尺度为1～100nm(10-9~10-7m)时，由于量子效应、巨大的表面与界面效应等效应，使物质的一些性质、性能发生了质变，产生了宏观物质所不具备的特殊性。因为其特殊性，纳米粒子在化学、材料、生物、医学等领域有着广泛的应用，引发了一场“新的工业革命”[1]。随着纳米材料的广泛运用潜在的负面影响也已引起人们的广泛关注。2003~2004年，Science等先后发表文章讨论纳米材料与生物环境相互作用可能产生的生物效应问题[2]。美国化学会以及欧洲许多学术杂志也纷纷对纳米生物环境效应问题进行调研。该报告建议英国政府成立专门研究纳米生物环境效应与安全性的研究中心[3]。2004年，欧共体在布鲁塞尔公布了“欧洲纳米战略”，把研究纳米生物环境健康效应问题列在欧洲纳米发展战略的第三位。同时，欧洲宣布启动“NanosafetIntegrairngProjects”计划，全面开展纳米生物效应与安全性的研究[2]。2001年，中国科学院高能物理研究所提出“开展纳米生物效应、毒性与安全性研究”，2004年对原有的纳米生物、稀土金属与重金属毒理和有机卤素的生物效应与毒理学研究组进行整合，成立了“纳米生物效应实验室”，与国内外有关研究组织合作，系统开展纳米物质生物效应的研究，已获得了一批研究成果[3]。目前，国内研究重点是纳米物质整体生物学效应以及对生理功能的影响、纳米物质的细胞生物学效应及其机制以及大气纳米颗粒对人体作用和影响等领域的研究。1.2纳米氧化锌纳米氧化锌是一种粒径大小约在1～100纳米的多功能新型无机材料。由于粒子纳米化，纳米氧化锌粒子的表面电子结构和晶体结构发生变化，产生了表面效应、体积效应、量子尺寸效应和宏观隧道效应等效应，以及高透明度、高分散性等宏观物体所不具备的特点。近年来发现它在催化、光学、磁学、力学等方面展现出许多特殊功能，使其在陶瓷、化工、电子、光学、生物、医药等许多领域有重要的应用价值[4~5] ，其特殊性和用途是普通氧化锌所无法比较的。在纺织领域中，纳米氧化锌可作为紫外光遮蔽材料、抗菌剂、荧光材料、光催化材料等。由于纳米氧化锌的特性和广泛的应用前景，因此许多科技人员将纳米氧化锌的研发设为焦点。目前纳米氧化锌的制备技术已经取得了一些突破，在国内形成了几家产业化生产厂家。1.3研究现状随着纳米氧化锌用途越来越广泛和用量越来越大，不可避免的会通过各种途径流入水体进入环境[6]，但目前极少关于纳米粒子在环境浓度的数据，但有很多知识已经存在证明纳米氧化锌粒子对生物系统的的影响。据估计，一旦纳米粒子进入水体，他们将最有可能聚集成沉积物和悬浮微粒物。悬浮粒子对鱼类影响较大，聚集粒子一般不移动，并可以互相影响滤食性和泥沙居生物。聚集程度受pH值，离子强度，以及电解质的性质等影响。目前在金属氧化物纳米颗粒大部分研究都集中在其抗菌和抑菌的应用程序或人类健康的影响，很少有研究探讨其潜在生态毒性[7]。Adams[8]用细菌革兰氏阴性大肠杆菌和革兰氏阳性芽孢杆菌作为两个模型比较了纳米TiO2，ZnO和SiO2的悬浮纳米的生态毒性。这项研究表明，ZnO纳米材料对枯草芽孢杆菌毒性最强，斑马鱼胚胎实验表明了类似的结果;纳米氧化锌超过二氧化钛或纳米氧化铝颗粒毒性[9]。很多知识已经存在证明氧化锌纳米粒子对生物系统的的影响。纳米氧化锌的光诱导，氧化还原活性，从而在其表面具有潜在活性氧簇（ROS）。纳米氧化锌已被证明产生的紫外光照射下生成活性氧或在无紫外线下消失[10]。对纳米氧化锌等金属纳米粒子毒性的确切机制在很大程度上是未知的，但最近的研究表明，纳米颗粒的毒性，与一般颗粒大小，形状和表面特性性能有关。有一篇最新报道关于纳米氧化锌生态毒性[11]，用水生生物，藻类，淡水无脊椎动物和鱼类等作为实验对象。在藻类，无脊椎动物和鱼类的测试中，淡水无脊椎动物，是目前存在研究数据最多的种类，其次是藻类，最后是淡水鱼。其他纳米颗粒生物群体之间的观察分布数据也大致相似。1.4研究目的虽然越来越多的关于纳米毒性信息相继变得可用，因为研究已经进行数量有限，且在水生物种类少，就环境毒理学方面有关的所有粒子来说，一个重要的知识差距依然存在令人满意的风险评估无法执行。鱼类等水生生物对水体环境的变化反应十分灵敏，而且水体中的有毒物质能通过食物链在生物体内积累并随着生物等级的提高而积累，而且由于体内蓄积得毒物会影响鱼类正常的生理机能。近年来，随着工农业的快速发展，大量的废物及污染物在环境中通过降尘、地表径流、降雨等途径进入水体，而且现在纳米材料因为对其生态毒性研究的不足并未受到监管的重视，其潜在危害日益严重，已经成为生态环境中待解决的前沿课题。斑马鱼(Brachydaniorerio或Daniorerio)，是一种小型热带鱼。由于产卵量大、易收集、饲养简单等特点，是国际标准化组织(ISO)推荐使用的鱼类毒性试验动物(国家环保局，1990)。现已成为一些生态毒理标准(如OECD和ISO标准)的推荐测试物种。此外，斑马鱼也是研究发育生物学、分子遗传学等的理想模型，用途十分广泛。由于其在生态毒理学上的广泛应用，选择以斑马鱼作为本课题的受试生物具有一定的代表性和可参考性。 为了填补信息差距，我们以斑马鱼作为模式生物研究纳米氧化锌对斑马鱼的毒性研究。本文的目的是确定纳米悬浮液对斑马鱼的潜在毒性，为纳米材料生态毒性的评估提供资料。2材料和方法2.1试验材料2.1.1试验动物斑马鱼（Brachydaniorerio）购自水族馆，每日定时喂食，水温恒定在25℃的条件，在驯养1周后，用于试验。2.1.1试剂和仪器纳米氧化锌购于杭州大洋公司，纯度为99.9％，用超声波震荡制成1.0、5.60和11.20mg/L的纳米氧化锌颗粒悬浮液。KD1508轮转式切片机，浙江金华科迪仪器有限公司。KD—T电脑生物组织摊烤片机。试验用水使用前均需进行除氯，本试验采用将自来水注入驯养鱼缸后曝气三天的方法。载玻片，盖玻片若干。所有玻璃容器在使用前均用0.4％高锰酸钾浸泡24h，并用去离子水冲洗干净，待用。2.2实验方法设立梯度浓度为0mg·L-1（对照组）、1mg·L-1、5.6mg·L-1和11.2mg·L-1的四组纳米氧化锌悬液，每组各加入斑马鱼15条，饲养条件同驯养期。由于定期吸出粪便及水分蒸发，使鱼缸内水量持续减少，因此每周更换一次新的纳米氧化锌悬液。饲养期间对斑马鱼行为观察和记录。暴露30天后分别对各缸斑马鱼进行活体取样，每组取五条鱼，取其鳃组织和肝组织，用Bouin’s液固定。固定后样品经梯度酒精（50%、70%、80%、90%、95%、100%）脱水，由二甲苯透明，石蜡包埋。切片厚度5um，常规H-E染色，使用倒置显微镜观察拍照。3结果3.1斑马鱼行为观察在染毒实验期间，对照组和处理组的受试鱼发生死亡。与对照组相比，暴露在浓度为1.0mg·L-1受试鱼未发生明显的行为异常，在浓度为5.60和11.20mg·L-1观察暴露1小时后鱼呼吸和摆动频率逐渐升高和行为变化，而且平均体质量低与对照组并且尾部畸形。3.2对照组斑马鱼鳃结构斑马鱼鳃的主要功能部位为鳃丝，鳃丝向两边伸出扁平囊状的鳃小片，鳃小片平行排列与鳃丝纵轴垂直。鳃丝主干包括鳃丝软骨(cartilage)、中央静脉窦(centralvenoussinus)、鳃丝上皮(filamentepithelium)。鳃丝上皮由一至两层上皮细胞组成。鳃小片由扁平细胞、柱细胞(pillarcells)、泌氯细胞等组成。对照组受试鱼的鳃小片上皮细胞结构完整，无损伤（图1a）。3.3处理组斑马鱼鳃结构变化在纳米氧化锌悬浮液浓度为1mg/L 时，斑马鱼肝未发现鳃组织损伤。当纳米氧化锌悬浮液浓度≥5.6mg/L时，观察到斑马鱼的鳃组织均受明显的损伤，主要为鳃小片上皮细胞发生肥大和水肿。经5.6mg·L-1处理的斑马鱼，还发生鳃丝上皮细胞增厚、部分鳃组织细胞核消失(图1c)，在11.2mg·L-1时这种显现越发明显（图1d）。可见，伴随纳米氧化锌浓度的升高，鱼的鳃组织受到的损伤加重。abcd图1纳米氧化锌暴露30d后斑马鱼的鳃组织结构变化（H-E；×400）a.对照组的鳃组织，鳃丝和鳃小片正常；b.纳米氧化锌浓度为1.0mg·L-1处理的鳃组织，未发现病变等现象;c.纳米氧化锌浓度为5.60mg·L-1处理的鳃组织，示鳃小片鳃丝病变（箭头）和细胞核缺失（星号）；d.纳米氧化锌浓度为11.20mg·L-1处理的鳃组织，示鳃丝明显病变（箭头）。3.4斑马鱼肝结构变化对照组斑马鱼的肝细胞质均匀，细胞核呈规则圆形，位于细胞中央(图2e)，肝细胞索相互交错。 实验组受试鱼在1mg/L时肝细胞正常并未发现的病变（图2f）。当纳米氧化锌悬浮液浓度≥5.6mg/L时，如图2g所示肝细胞肿大，其细胞形状变得不规则，细胞核发生偏离细胞中心。在悬浮液浓度高达11.20mg/L时，如图2h所示细胞质中空泡化程度加重，部分肝细胞出现细胞核消失引起肝组织局部坏死。efgh图2纳米氧化锌暴露30d后斑马鱼肝组织结构变化（H-E；×400）e.对照组斑马鱼肝组织，胞质均匀，肝细胞呈圆形，细胞核呈圆形位于细胞中央；f纳米氧化锌浓度为1.0mg·L-1处理的肝组织，未发现病变等现象；g.纳米氧化锌浓度为5.60mg·L-1处理的肝组织，示细胞核偏移（箭头）和细胞空泡化（星号）；h.纳米氧化锌浓度为11.20mg·L-1处理的肝组织，示细胞核偏移（箭头）和细胞空泡化（星号），组织坏死（三角形）。4讨论 4.1纳米氧化锌斑马鱼鳃结构的影响鳃是鱼类的重要呼吸器官，鱼体与外环境的气体交换主要由鳃来完成。鳃发生病变鱼类呼吸不畅，必然影响鱼类的正常代谢和生长。也是重要的排泄器官，鳃组织的病变将造成氨氮的排泄受阻，血液中氨氮含量升高，将影响到鱼体内渗透压调节机能。因为鱼类的鳃与水直接接触，并且对水体的污染物敏感，容易受到水体中污染物的作用而损伤，进而影响其正常的生理功能，危及鱼体健康。而且鱼的鳃是污染物作用的主要靶器官，鳃的生理和结构变化可以作为水体受污染的程度的指标，同样也能直接反应污染物对鱼毒害的程度[12]。水环境中有毒物质作用于鱼类的鳃组织，其损伤可划分为两类：一是防御损伤，主要表现为鳃丝上皮细胞肥大和增生、鳃小片的呼吸上皮水肿等；二是直接损伤，主要表现鳃上皮细胞坏死和脱落等。本实验中，纳米氧化锌作为唯一的变量，观察纳米氧化锌对斑马鱼鳃组织的作用，当浓度为1mg/L时斑马鱼的鳃组织并未发现变化，当其暴露在5.6mg/L的纳米氧化锌悬液30天，其主要变化鳃上皮细胞肥大，并伴有细胞核缺失，并且随着浓度的增高受试鱼鳃上皮细胞增生越严重。吴玲玲[13]等在1.0ug·L-1的林丹水溶液中暴露36d后,与对照组相比,斑马鱼的鳃组织表现出异常:上皮细胞残损、脱落、鳃小片上皮细胞水肿以及柱细胞变形;当林丹水溶液浓度提高到100.0ug·L-1时,曝露36d后,斑马鱼的鳃小片上皮细胞水肿、柱细胞变形,鳃小片之间有融合现象,反映了林丹对斑马鱼鳃的毒性。Jeanmarie[14]等对斑马鱼腹腔注射70ng·g的TCDD(2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-P-dioxin)，5天后，发现斑马鱼鳃小片上皮肥大、明显隆起。而Upatham[15]等将尼罗罗非鱼(Oreochromisnitius)暴露在不同浓度的草甘膦除草剂(GlyphosateHerbicide，C3H8NO5P)3个月，结果发现不论5还是15mg·L-1的草甘膦除草剂中，鳃丝的上皮细胞均有增生并导致鳃小片间发生不同程度粘联，而荡草甘膦浓度为15mg·L-1时，发现罗非鱼鳃小片的顶端膨大呈杵状。可见，鱼鳃组织细胞会因水环境中含有的毒物种类、作用时间和浓度，以及鱼的种类不同而出现损伤的现象有所差异。所以，斑马鱼鳃组织的病理学变化表示纳米氧化锌污染的程度。此外，本实验中观察到纳米氧化锌对斑马鱼鳃的作用主要表现为防御反应，主要是鳃丝上皮增厚、鳃小片上皮细胞肥大和水肿。鳃组织的防御作用可以阻碍毒物摄入，增加毒物扩散到血液的距离，从而延缓和减轻毒性作用，但是，防御反应降低了鳃的气体和物质交换效率，即鱼的呼吸效率，影响了鱼的循环系统，从而破坏鱼体的生理功能，影响了其新陈代谢，危及其机体健康甚至造成死亡。本研究中，在浓度≥5.60mg/L的纳米氧化锌悬液中暴露后的斑马鱼，发现暴露在纳米氧化锌组斑马鱼的质量低于对照组，即说明鳃正常功能受阻，加之肝脏损害，影响了机体的新陈代谢，并且纳米氧化锌对斑马鱼鳃的毒性有明显的剂量-效应关系，在11.2mg/L时，其鳃组织结构的变化明显比5.6mg/L的鱼鳃组织结构更为严重。4.2纳米氧化锌斑马鱼肝结构的影响肝脏是斑马鱼和大多数脊椎动物的解毒器官，侵犯机体的有毒异物多在肝脏中集中，所以肝脏也是毒害物质的主要靶器官之一。当有毒物质浓度过高会造成肝细胞损伤，使肝细胞结构表现异常和病变。鱼类暴露在受污染水环境中其肝组织会发生结构和生理变化[16] 。生态毒理学研究中可以运用鱼的肝组织结构变化作为水环境中有毒物质污染作用的生物标记物。通常情况下鱼类受到有毒物质作用后，通常会发生肝细胞肿大、细胞核偏移、空泡化和坏死。本实验中，纳米氧化锌是主要变化因子，在5.60和11.20mg·L-1纳米氧化锌悬液中暴露30d，斑马鱼的肝组织结构已经出现明显的损伤，主要表现为肝细胞肿大、细胞核偏离细胞中心，甚至消失，而且在浓度为11.20mg·L-1时观察到肝细胞细胞核消失和组织坏死。然而鱼类在中毒严重时，才表现为肝细胞的细胞核固缩、细胞破裂和溶解，细胞功能发生衰退，终致组织坏死。这说明纳米氧化锌对斑马鱼表现出强烈的毒性。。4.3纳米氧化锌对斑马鱼的毒性机理目前,纳米材料的毒性机制尚未清楚，可能粒子的粒径为纳米级，与细胞膜孔径、核膜孔径和离子通道等处于相同尺度，容易进入细胞，而且由于尺寸效应，其表面活性、电子稳定性、溶解性和光学性质等效应的共同作用造成细胞膜完整性破坏、氧化胁迫、线粒体等重要细胞器损伤、蛋白质氧化和变性并丧失功能、基因毒性、毒性物质的释放等。这些致毒机制主要由纳米材料的自身性质决定[18]。同样纳米颗粒对生物系统的影响是全方位的，已有学者综述了纳米颗粒进入人体的途径、作用器官以及可能引发的健康问题，也证实了纳米粒子可能进入机体中枢神经系统和心脏等重要组织[20]。在国内外，已有许多研究都表明：纳米材料的生物效应与纳米颗粒的尺寸有相关性[21]。锌颗粒(58±16nm和1．08±0．25nm)对小鼠的急性毒性研究表明：纳米锌小鼠的肝、肾、心功能有损伤，并有胃肠道反应，而微米锌在同剂量下出现异常应症状少；1周内纳米锌组小鼠死亡率为10％，微米锌组无死亡[22]。有学者根据目前的研究运用细胞及分子学机制，提出纳米材料导致肺组织炎症的假设[23]为：因为纳米级颗粒具有氧化胁迫作用，能在细胞内产生作用从而导致肺组织细胞脂质过氧化产物如氧化型谷胱甘肽的产生和4-hydmxynonenal的生成。破坏细胞内的氧化还原平衡，从而导致炎症。而且，细胞与颗粒的相互作用和颗粒的氧化胁迫都能刺激细胞质内Ca2+浓度的上升，这也会引起抗氧化产物含量上升从而引发炎症。另外，纳米材料引起肺组织炎症可能和巨噬细胞有关[24]。不同的纳米材料（如SWCNTs和CB）被肺泡巨噬细胞吸收，但是不同材料在肺组织中的反应却不同[25]。吸收SWCNTs的巨噬细胞会快速移动到肺小叶中央位置，并且聚集在肺泡隔膜，导致肉芽瘤生成，而吸收CB的巨噬细胞会分散在肺泡空间中。李小云等[5]实验纳米ZnO可以在鱼体内富集。颗粒态锌在鱼鳃和鱼肉中的积累，颗粒态锌在鱼鳃和鱼肉的积累都随锌浓度的升高而升高，颗粒态鱼鳃积累尤其大于鱼肉，其他形式进入鳃组织，再转移到血液的浓度梯度驱动的被动扩散过程。有研究发现，纳米TiO2能够进入鲤鱼（Cyprinuscarpio）体内，造成鳃和肝的病理学变化并产生氧化损伤。5总结根据实验结果，可以得出以下结论:a5.6mg/L的纳米氧化锌中的斑马鱼，其鳃组织出现增生，水肿，斑马鱼的肝组织也发生明显的损伤，说明本研究使用的纳米粒子对斑马鱼有毒性作用。b随着纳米氧化锌浓度的增加，斑马鱼的肝和鳃组织损伤越严重。纳米氧化锌对生物的毒性具有剂量-效应已从关系。 c与传统的化学品相比，在目前的测试的纳米粒子尺度越小毒性越强，这表明适用于“传统”化学品的现行法规评需要重新适用于纳米材料。应建立新的法规，不仅是化学成分，而且根据大小，如化学性质的纳米级的变化来建立新法规。本研究提出的结果表明，纳米氧化锌潜在生态毒性和环境健康的影响不容忽视。到达生态途径和环境效应试验应包括商业产品是主要类别代表的纳米材料（例如，此处测试的金属氧化物和碳为基础的纳米颗粒），特别是那些最有可能进入水生环境释放的纳米材料。 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