纳米Al2O3对斑马鱼组织结构的影响【毕业设计】 11页

本科毕业设计（20__届）纳米Al2O3对斑马鱼组织结构的影响9 目　录摘　要1Abstract11前言21.1研究背景与意义21.1.1纳米氧化铝应用的高速发展21.1.2纳米材料对生态的潜在危害21.2国内外研究现状21.2.1纳米毒理学的研究21.2.2纳米氧化铝的生物效应研究31.3本课题的研究目标32材料与方法32.1材料32.1.1斑马鱼驯养32.1.2纳米氧化铝处理32.2试验方法33实验结果43.1斑马鱼死亡记录和行为观察43.2纳米氧化铝对斑马鱼鳃组织的影响43.2.1对照组鳃组织结构43.2.2实验组鳃组织结构43.3纳米氧化铝对斑马鱼肝组织的影响53.3.1对照组肝组织结构53.3.2实验组肝组织结构74分析与讨论74.1鳃组织损伤分析74.2肝组织损伤分析75结论8参考文献9致谢109 摘　要摘要：采用浓度为0、5、10、20mg·L-1的纳米氧化铝悬液对斑马鱼进行45天的暴露实验，研究纳米氧化铝对斑马鱼肝、鳃组织的组织结构影响。H-E染色结果显示，纳米氧化铝的浓度为5mg·L-1时已经能对斑马鱼的肝组织和鳃组织产生毒害效应，其中对鳃组织的损害以防御性损伤为主，肝组织细胞出现细胞核固缩变形和细胞的大量空泡化。当浓度达到10mg·L-1时，斑马鱼所受损伤加重，表现为细胞损伤区域扩大以及受损伤细胞的比例增大。20mg·L-1纳米氧化铝对鳃组织有更加严重的直接伤害，导致鳃上皮细胞的脱落。实验表明，水环境中的纳米氧化铝的浓度为5mg·L-1时就可以对斑马鱼的肝、鳃组织造成明显有害影响。随着浓度的增加，伤害趋于恶劣。关键词：纳米Al2O3；斑马鱼；组织结构；纳米材料AbstractAabstract:Inthisstudy,Brachydanioreriowasexposedtonumbersofconcentrationsofnano-Al2O3(0、5、10、20mg·L-1)for45days,andthehistopathologicaleffectsofnano-Al2O3onBrachydanioreriogillandliverwereexaminedunderlightmicroscope.Theresultsshowedthatat5mg·L-1nano-Al2O3,thereissometoxiceffectsappeartoBrachydanioreriogillandliver.Inthiscase,thedamageofgillaretobephylacticreactions,thehepaticlesionswerecharacterizedbythehypertrophyofhepatocytesandvacuolization.Afterexposureto10mg·L-1nano-Al2O3,thedamageoflivergotworseasthedamagedzonewereenlargeandthenumberofdamagedcellsweremorethanitwhichconcentrationare5mg·L-1.20mg·L-1nano-Al2O3hadadirectdamagetothegill,whichgotthecellofthefilamentepitheliumshedding.Thiscaseshowsthat5mg·L-1nano-Al2O3candamagetheBrachydanioreriogillandliver,andthehighconcentrationoftheenvironmentitis,theworseeffectitgets.Keyword:nano-Al2O3;Brachydaniorerio;organisation;nano-material1前言1.1研究背景与意义1.1.1纳米氧化铝应用的高速发展9 纳米材料是由尺寸只有数个纳米级别的微小颗粒组成的具有特殊性能的材料。其小尺寸效应、表面效应、量子尺寸效应和宏观量子隧道效应等这些特殊的效应使纳米材料在机械、电子、医药、化工、军工等诸多领域都具有十分广泛的应用。这些特性使纳米科学已经成为当今世界上三大支柱科学(生命科学、信息科学、纳米科学)之一[1,2,3]。纳米技术可以减少原料消耗，减少污染排放，降低成本，提高性能等等优势，人们迫切需求利用其对传统工业技术进行改造。随着纳米技术的产业化，各种形式的纳米尺度的物质已经以各种不同的途径进入我们赖以生存的生态环境中[4,5,6]。氧化铝是白色晶状粉末，其中活性氧化铝被广泛地被用作化学反应的催化剂和催化剂载体，是一种多孔性、高分散度的固体材料，有很大的表面积，其微孔表面具备催化作用所要求的特性，如吸附性能、表面活性、优良的热稳定性等。通过不同的制备方法及工艺条件可获得不同结构的纳米氧化铝。其中主要的是活性氧化铝，如β-Al2O3、γ-Al2O3的比表面较大，孔隙率高、耐热性强，成型性好，具有较强的表面酸性和一定的表面碱性，被广泛应用作催化剂和催化剂载体等新的绿色化学材料。多孔性；硬度高、尺寸稳定性好，可广泛应用于各种塑料、橡胶、陶瓷、耐火材料等产品的补强增韧，特别是提高陶瓷的致密性、光洁度、冷热疲劳性、断裂韧性、抗蠕变性能和高分子材料产品的耐磨性能尤为显著。同时其极好分散，在溶剂水里面；溶剂乙醇、丙醇、丙二醇、异丙醇、乙二醇单丁醚、丙酮、丁酮、苯、二甲苯内，不需加分散剂，搅拌后即可以充分的分散均匀[4]。1.1.1纳米材料对生态的潜在危害随着纳米材料在各个领域被广泛地应用，纳米材料的生物效应引起了人们的关注。2003年4月Science、2003年7月Nature，相继发表文章，开始讨论纳米尺度物质的生物效应、对环境和健康等可能带来的潜在影响。在之后的众多研究当中，人们发现纳米材料如TiO2、碳纳米管等纳米材料对生物有一定的生理毒性。如Afaq等用支气管注入法研究超细TiO2（<30nm，用量2mg）对大鼠的毒性时，发现肺泡巨噬细胞的数量增加，同时细胞内的谷胱甘肽过氧化酶、谷胱甘肽还原酶、6-磷酸葡萄糖脱氢酶、谷胱甘肽硫转移酶的活性均升高。而且，酶活性升高并没有阻止脂质过氧化和过氧化氢的生成，这表明受到TiO2纳米颗粒作用时，尽管细胞启动自我保护机制诱导了抗氧化酶的生成，却未能消除TiO2纳米颗粒产生的毒副作用。随着人们对纳米材料生态效应的日益重视，纳米材料越来越多的对生物的毒副作用也被实验发现和证明。在高速发展纳米技术的同时，我们也应该考虑纳米材料对环境和健康的潜在危害。但是，这些新材料的性能很难在短时间内被完全鉴定，其生物效应如对生物世代的影响需要长期多方面的考察和研究。铝具有一定的神经毒性，对骨代谢也有明显影响，过量铝摄入可致其在器官中蓄积。铝中毒机制与铝可拮抗其他微量元素、影响一些相关酶的活力、增强铁催化自由基生成和诱发氧化损伤有关。纳米材料由于其特殊的尺寸和性能可能会有不同的毒性。1.2国内外研究现状1.2.1纳米毒理学的研究目前对纳米材料毒理学的研究尚处于起步阶段，研究多集中在SiO2、TiO2、碳纳米管、富勒烯和纳米铁粉等材料上面[2]。迄今为止的相关研究按其所用材料可以大致分为：（1）针对水生无脊椎动物（如水蚤）的生态研究；（2）针对水生脊椎动物（如斑马鱼）的生态和毒理研究；（3）针对小型哺乳动物（如小鼠等）的生态和毒理研究。大量的研究指出，大多数的纳米材料对生态有负面的影响，甚至会威胁到人类的生命健康安全[7,8]。1.2.2纳米氧化铝的生物效应研究国内外对于纳米氧化铝的生物效应研究还很少，相对于纳米氧化铝的广泛应用，其生态效应研究严重滞后[3]9 。但是，目前也有一些研究取得了一定的进展。如王天成等研究研究了两种粒径的氧化铝（粒径为20nm的纳米氧化铝和粒径为0.15um的微米氧化铝）对小鼠血清生化指标的影响。通过实验发现，经纳米氧化铝处理的小鼠血清中的乳酸脱氢酶（LDH）和羟丁酸脱氢酶（HBDB）与对照组相比明显降低，而微米氧化铝却没有发现该情况。这说明纳米氧化铝有着较高的渗透能力。纳米氧化铝处理组血清中碱性磷酸酶（ALP）明显高于对照组和微米氧化铝，说明其对小鼠骨代谢有一定影响。纳米氧化铝在水和各种有机溶剂中有很强的分散性，纳米材料可以通过各种途径最终进入水体。水生生态环境是地球生态环境的基础，对纳米氧化铝在水生生态环境的安全评估越来越重要，因此，亟待相关研究弥补当前参考资料的空白[3]。1.1本课题的研究目标本课题对各个环境纳米氧化铝浓度下斑马鱼生活习性进行了观察，并对其肝、鳃组织进行组织切片的对比，就纳米氧化铝的毒理做出了初步探讨。鉴于纳米氧化铝的生态效应研究的严重滞后，本课题为进一步探讨纳米氧化铝的毒性毒理研究提供资料，并为纳米氧化铝材料的进一步应用开发的生态局限提供参考。通过结合纳米材料对特定酶活力、相关基因表达等方面进行进一步的研究，可以比较完备深入地了解纳米氧化铝的毒性毒理和生态效应。2材料与方法2.1材料斑马鱼(Brachydaniorerio或Daniorerio)，是一种小型热带鱼。由于产卵量大、易收集、饲养简单等特点，是国际标准化组织(ISO)推荐使用的鱼类毒性试验动物(国家环保局，1990)。现已成为一些生态毒理标准(如OECD和ISO标准)的推荐测试物种。此外，斑马鱼也是研究发育生物学、分子遗传学等的理想模型，用途十分广泛[7]。由于其在生态毒理学上的广泛应用，选择以斑马鱼作为本课题的受试生物具有一定的代表性和可参考性[14,20]。本实验采用斑马鱼均购自宁波市蓝光水族馆，体长3.5cm至4cm的成鱼，雄雌约各占一半。纳米氧化铝购于杭州大洋纳米新材料有限公司，平均粒径30±5nm，白色粉末状。2.1.1斑马鱼驯养新购斑马鱼在5%的氯化钠溶液中消毒10分钟，转移至干净鱼缸中。养鱼用水为自来水滴加除氯液后曝晒2-3天。保持水温为25℃，以充气泵向水中充气以保证氧气供应，采用自然光照，每日定期给食。驯养一周后选取无异常者进行试验。2.1.2纳米氧化铝处理分别称量50mg、100mg、200mg纳米氧化铝于250ml烧杯中，加200ml水后于超声清洗机中加速分散3-5分钟。各自加入10L鱼缸中配成5mg·L-1、10mg·L-1、20mg·L-1悬液。2.2试验方法设立梯度浓度为0mg·L-1（对照组）、5mg·L-1、10mg·L-1和20mg·L-1的四组纳米氧化铝悬液，每组各加入斑马鱼20条，饲养条件同驯养期。由于定期吸出粪便及水分蒸发，使鱼缸内水量持续减少，因此每周更换一次新的纳米氧化铝悬液。饲养期间对斑马鱼行为和死亡情况进行观察和记录。暴露45天后分别对各缸斑马鱼进行活体取样，取其鳃组织和肝组织，用Bouin’s液固定。固定后样品经梯度酒精（50%、70%、80%、90%、95%、100%）脱水，由二甲苯透明，石蜡包埋。切片厚度5um，常规H-E染色，使用倒置显微镜观察拍照。9 实验结果1.1斑马鱼死亡记录和行为观察实验中，在前期（第十天左右）各组斑马鱼（包括对照组）均有1-2条死亡，这可能与整体环境有关。在其后将近50天的时间里，各组均未出现非意外死亡。暴露时间超过15天后，暴露在纳米氧化铝悬液中的斑马鱼活动量较对照组明显减少，而且对周围环境如声音和人员靠近也更敏感。这一变化在各个纳米氧化铝悬液浓度之间并无明显差异。1.2纳米氧化铝对斑马鱼鳃组织的影响1.2.1对照组鳃组织结构斑马鱼鳃的主要功能部位为鳃丝，鳃丝向两边伸出扁平囊状的鳃小片，鳃小片平行排列与鳃丝纵轴垂直。鳃丝主干包括鳃丝软骨(cartilage)、中央静脉窦(centralvenoussinus)、鳃丝上皮(filamentepithelium)。鳃丝上皮由一至两层上皮细胞组成。鳃小片由扁平细胞、柱细胞(pillarcells)、泌氯细胞等组成[3,14]。对照组受试鱼的鳃小片上皮细胞结构完整，无损伤（如图一）。1.2.2实验组鳃组织结构图一：对照组斑马鱼鳃丝切片实验组斑马鱼在暴露30天后，各组斑马鱼鳃组织均有观察到明显损伤，包括鳃丝上皮增厚、鳃小片呼吸上皮细胞发生肥大(hypertrophy)和水肿(edema)，伴随着鳃小片部分肿大和部分细胞空泡化。各个不同纳米氧化铝悬液浓度实验组之间均有出现以上情况（如图二至图五）。在20mg·L-1浓度中的个别切片中出现鳃小片呼吸上皮细胞的脱落。图二：实验组（30d）鳃小片顶部增生膨大500umum9 50um50um图三：实验组鳃组织上皮细胞水肿和空泡化图四：实验组鳃组织部分上皮明显隆起125umum125umum图六：实验组鳃小片呼吸上皮细胞出现水肿（星号示）和脱落（箭头示）。图五：实验组鳃小片呼吸上皮细胞水肿，伴随着鳃小片部分肿大和部分细胞空泡化。1.1纳米氧化铝对斑马鱼肝组织的影响1.1.1对照组肝组织结构正常斑马鱼肝细胞胞质均匀，细胞核呈规则圆形，位于细胞中央。对照组肝细胞如下图所示。其细胞核完整，呈圆形，核仁清晰[3]。50um图七：对照组斑马鱼肝组织切片，细胞核呈圆形，核仁被深染，清晰地位于核中心。9 125umum50um图九：实验组肝组织，细胞核固缩变形图八：实验组肝组织，细胞核固缩变形50um50um图十一：实验组肝组织，细胞核破裂图十：实验组肝组织，细胞核溶解250umum125umum图十三：实验组肝组织，大量细胞核偏离细胞中心图十二：实验组肝组织，部分细胞出现空泡化9 1.1.1实验组肝组织结构实验组斑马鱼的肝组织出现局部的细胞病变，就组织切片的观察而言主要表现为细胞空泡化，细胞核偏离细胞中心以及细胞核的破损，如固缩变形、破裂、溶解（如图八至图十三）。上述细胞病变在各个浓度实验组的斑马鱼肝组织中均有发现。比较各个浓度实验组之间的差异发现，5mg·L-1和10mg·L-1三氧化二铝浓度的斑马鱼组织与较高浓度实验组（20mg·L-1）相比在病变局部数量较少，病变范围也较小。而5mg·L-1和10mg·L-1两组间无明显差异。2分析与讨论2.1鳃组织损伤分析鳃是斑马鱼的呼吸器官，腮呼吸也是纳米氧化铝进入斑马鱼体内的主要途径。同时，鳃组织也是斑马鱼免疫和病理防御的前哨[18]。鱼类在水环境有毒物质作用后，使鳃组织细胞受到一系列的损伤，这些损伤可以分为两类：一是直接造成的损伤，包括鳃上皮细胞的坏死和脱落；二是防御性损伤，包括鳃丝上皮细胞肥大增生，鳃小片呼吸上皮细胞水肿等（Cengiz&Unlu，2006）。本研究中，大量的出现鱼鳃丝上皮增厚、鳃小片呼吸上皮细胞水肿等防御反应。这些防御反应可以阻碍毒物的摄入，从而延缓恶化减轻毒性效应，对鱼体有一定的保护作用。但是，防御反应降低了鳃的气体和物质交换效率，即鱼的呼吸效率，影响了鱼的循环系统，从而破坏鱼体的生理功能，影响了其新陈代谢，危及其机体健康（Liaoetal.，2006）。本实验中，暴露在纳米氧化铝中悬液的斑马鱼的鳃组织大都出现包括鳃丝上皮细胞的肥大增生、鳃小片上皮细胞水肿等防御性损伤。而这种防御性损伤在各个不同浓度纳米氧化铝的实验组之间没有表现出明显差异，也即是说，5mg·L-1、10mg·L-1和20mg·L-1纳米氧化铝悬液环境下，斑马鱼鳃组织表现出相同程度上的防御性反应。防御性反应的普遍存在也说明5mg·L-1纳米氧化铝悬液已经能对斑马鱼造成了一定毒性伤害，而浓度的差异并没有使其防御反应升级。另一方面，虽然在各个实验组之间都有发现鳃丝上皮细胞的坏死和脱落，但这种直接的伤害更集中于更高浓度纳米氧化铝环境下的斑马鱼。纳米材料进入斑马鱼体内的主要途径是通过鳃的呼吸作用，即通过鳃上皮细胞进入鳃血管[19]。高浓度的纳米氧化铝环境使鳃上皮细胞中纳米氧化铝的富集作用更加明显，而细胞中纳米氧化铝的富集可能会直接对细胞造成伤害，进而出现坏死和脱落。2.2肝组织损伤分析肝脏是斑马鱼和大多数脊椎动物的解毒器官，侵犯机体的有毒异物多在肝脏中集中，所以肝脏也是毒害物质的主要靶器官之一。鱼类只有在严重中毒时才会出现类似本实验结果的肝细胞细胞核固缩症状（Gingerrich，1982），这种细胞核的固缩常伴有细胞破裂和溶解出现。而本实验中暴露在纳米氧化铝悬液中的斑马鱼的肝组织出现局部肝细胞固缩和其他的细胞核破损，但没有发现相关的细胞破裂和溶解。这可能是由于纳米氧化铝这一纳米材料的生物毒性有其特殊的毒理作用。吴玲玲等（2007）发现菲对斑马鱼的肝组织结构也有类似的影响，常常还伴有细胞的空泡化和局部的坏死[18]。细胞空泡化一般被认为是由于肝细胞内物质合成速度与向循环系统释放速度失衡而导致（Gingerich1982），也有可能是由于肝细胞中化合物含量变化如肝糖原的积累造成(Wester&Canton，1986)。值得注意的是，在鱼类受到毒物作用时，肝糖原含量通常会增加，肝组织的水含量和脂含量也会发生相应变化(Liaoeta1．，2006)，这可能是本试验中细胞空泡化地主要原因。本实验中的主要变化因子是纳米氧化铝，而空泡化是其对肝组织细胞影响的主要表现之一。肝组织是一个集消化、贮藏等多种功能的多功能器官，其代谢非常旺盛[22]。实验中暴露在纳米氧化铝中的斑马鱼的肝组织切片显示，大量的细胞核偏离细胞中心，紧贴细胞膜或角落，这不利于核基因的表达，进而降低其代谢效率，最终影响机体运行。本实验中较低浓度实验组和较高浓度实验组都有发现相同的症状，但高浓度实验组的受试斑马鱼肝组织受到更严重的损害。这说明5mg·L-1纳米氧化铝悬液在慢性毒实验中对斑马鱼肝组织已具有一定的生理毒性。联系暴露在5mg·L-19 纳米氧化铝悬液中斑马鱼的鳃组织结构的变化，这中毒害影响了机体的正常运转，使其产生防御性反应。1结论研究表明，水环境中的纳米氧化铝对斑马鱼的肝组织和鳃组织有负面影响。纳米氧化铝浓度达到5mg·L-1（0.5×10-4mol·L-1）时已经能对斑马鱼的肝组织和鳃组织产生毒害效应，其中对鳃组织的损害以防御性损伤（上皮细胞肥大、水肿）为主。当浓度达到20mg·L-1（2.0×10-4mol·L-1）时，斑马鱼的肝组织受到的损伤加重，而且对鳃组织有更加严重的直接伤害（上皮细胞的坏死、脱落）。9 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