纳米Al2O3对斑马鱼组织结构的影响【开题报告+文献综述+毕业设计】 24页

本科毕业论文系列开题报告生物技术纳米Al2O3对斑马鱼组织结构的影响一、选题的背景与意义纳米技术是当今高科技发展中最快的领域之一，大约超过200种的纳米材料被用于个人、商业、医药和军事等领域。随着纳米材料所带来的利益的同时，对纳米材料释放到环境中并对环境及生物所造成的潜在毒性也受到越来越多学者的关注。有研究表明，当宏观物质被粉碎成纳米级超微颗粒后，其诸多方面的性质均发生了根本性改变，纳米颗粒特殊的理化性质（如小尺寸效应、表面效应、量子尺寸效应和宏观量子隧道效应等）使其与宏观材料在生物活性和生物动力学过程等方面产生了明显差异，因此对机体产生的生物效应和作用强度也发生了本质上的改变，一些原本无毒或微毒的颗粒粒径达到纳米级时毒性明显增强，一些原本无害的材料在达到纳米级时可能会对人体产生各种潜在危害（汪冰等，2005；朱融融等，2007）。铝有一定得铝有一定的神经毒性，对骨代谢也有明显影响，过量铝摄入可致其在器官中蓄积（申冬杰，2003；王小波等，1997）。Al2O3吸入可能造成刺激或肺部伤害。nano-Al2O3的比表面较大，孔隙率高、耐热性强，成型性好，具有较强的表面酸性和一定的表面碱性，被广泛应用作催化剂和催化剂载体等新的绿色化学材料。因而，越来越多的纳米氧化铝在使用的过程中会有意无意的排放的环境中，最终进入到水环境，因此，其对水生生物及水生生态系统是否有影响，是值得关注的问题。目前对于纳米材料对于生物环境的影响方面的研究主要以纳米TiO2、纳米SiO2、纳米铜、铁等纳米颗粒为主，关于nano-Al2O3的研究主要集中于其各种理化性质的应用方面的探索，nano-Al2O3的潜在应用前景被更多的发掘出来，它的环境安全性的评估必将引起更大的重视。相对于其理化应用方面的研究，对nano-Al2O3的环境安全性研究有一定得滞后性。通过研究nano-Al2O3对斑马鱼组织结构的影响，可填补这方面的空白，并为该领域的研究提供参考，积累数据，和更深入了解nano-Al2O3的毒性以及其生物作用机制提供基础依据。所以本课题的研究是具有实际意义的。24 二、研究的基本内容与拟解决的主要问题：研究的基本内容：1、观察0mg/L、5mg/L以及10mg/Lnano-Al2O3浓度环境下喂养的斑马鱼在试验期间的摄食等行为变异以及异常死亡情况。2、在染毒30天和45天后对各组斑马鱼的肝、腮等典型组织进行取材和组织切片和显微观察。拟解决的主要问题：组织切片的HE染色。三、研究的方法与技术路线：研究方法：（一）驯化。对斑马鱼进行7天实验室驯化，使其适应实验条件。水温24℃左右，充气泵供氧，每天晚上8点喂食一次。（二）染毒。将驯化过的斑马鱼分组饲养于nano-Al2O3浓度为0mg/L、5mg/L和10mg/L的环境中，其余条件不变。染毒时间为30天和45天。（三）取材。迅速取出染毒斑马鱼的鳃组织以及肝组织，用生理盐水洗去残余血液。（四）固定。于Bouin液中进行组织固定，固定时间为8小时。（五）脱水。逐步经过浓度为70%，80%，90%，95%，100%的酒精中，每级脱水时间为3~5分钟。（六）透明。在透明前先将组织在无水乙醇与二甲苯等量混合液中处理3-5分钟。然后再用二甲苯透明处理5分钟（七）浸蜡与包埋。50℃左右浸蜡。浸蜡分三步进行，逐级提高石蜡-二甲苯比重。56℃左右包埋于包埋盒中。（八）切片。常规石蜡切片，切片厚度3-5um。45℃水温下摊片，60℃下烤片40分钟以上。（九）染色。常规HE染色。二甲苯中脱蜡30-45分钟，无水乙醇与二甲苯等量混合液处理5分钟后经100%、95%、90%、80%、70%、60%乙醇复水，每级处理3分钟左右。于纯水中苏木精染色30分钟左右。（十）显微观察。技术路线：驯化，染毒24 取材(肝、腮)Bouin固定脱水、透明个体行为观察包埋切片染色细胞的形态机能观察分析报告四、研究的总体安排与进度：2010.9-2010.10查阅文献和资料、准备实验材料和仪器。2010.11-2011.1进行实验和外文文献的翻译。2011.3-2011.4完成毕业论文。五、主要参考文献：[1]朱融融,汪世龙,孙晓宇等.β-CD对纳米TiO2引发DNA损伤的抑制效应及其机理［J］.中国科学B辑,2007,37:64-67.[2]汪冰,丰伟悦,赵宇亮等.纳米材料生物效应及其毒理学研究进展［J］.中国科学B辑,2005,35:1-10.[3]肖国强,徐晓宇,蔡文君等.纳米二氧化钛对小鼠肝、肾细胞DNA的损伤[J].生态毒理学报,2008,3（6）：590-595.[4]刘伟成,李明云.斑马鱼及其人工繁殖[J].水利渔业,2006,26(1):31[5]24 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毕业论文文献综述生物技术斑马鱼在纳米生物学中的应用摘要：斑马鱼作为一种模式脊椎动物，已经在纳米生物学的研究方面得到了广泛的应用。本文阐述了斑马鱼的特点，以及其应用于纳米生物学上的成果和前景。关键词：斑马鱼;应用;纳米生物学斑马鱼(Daniorerio)俗称蓝条鱼、花条鱼、斑马担尼鱼，隶属辐鳍亚、纲鲤科、短担尼鱼属，体侧具有像斑马一样纵向的暗蓝与银色相间的条纹。是一种产于孟加拉和印度等国的热带观赏鱼。作为模式脊椎动物，斑马鱼在发育生物学和遗传学以及毒理病理学上有着广泛的应用。随着纳米技术的迅速发展，纳米生物学的研究得到越来越多的关注。人工纳米材料可通过直接排放、废弃物排放、常规使用等多种途径进入水环境。进入水环境的人工纳米材料可通过食物链在鱼类等水生生物体内富集并最终进入人体，对人体健康构成威胁。因此，有关人工纳米材料对水生生物的毒性研究日益增多，而斑马鱼在其中发挥着重要作用并有着更广阔的应用前景。本文从斑马鱼在研究中的特点、在纳米生物学研究中的应用和应用前景几方面作一综述。1、斑马鱼的特点斑马鱼成鱼体型较小，胚胎透明且体外发育，易于活体观察；生长发育快，受精后24小时主要器官原基基本形成，便于研究组织器官的发育和功能；繁殖能力强且易于饲养。斑马鱼早在20世纪30年代，就作为经典的生长和胚胎模型。在20世纪70年代开始受到科学家们的关注，并成为最重要的模式脊椎动物之一。Streisinger等在Nature上发表了斑马鱼的体外受精技术、单倍体诱导技术，建立了纯品系，并介绍了斑马鱼的第一个自然突变体——golden，这是斑马鱼成为模式动物新宠的开端。自20世纪90年代初以来，斑马鱼因其多方面的优点已成为模式动物家族中重要的一员，受到越来越多的重视和利用。斑马鱼由于发育前期细胞分裂快，胚体透明，特定的细胞类型易于识别等有利因素，成为脊椎动物中最适于做发育生物学和遗传学研究的模式生物。随着今年来的研究发现，斑马鱼虽然不是哺乳动物，但是随着斑马鱼基因技术得到了发展，如克隆，转基因技术，诱变和绘制方法，以及斑马鱼基因组测序工程的完成，发现斑马鱼的基因与人类的基因保守度达到85％。斑马鱼在纳米生物学上应用的优异性主要为以下几点：1.124 、物种稳定，个体差异性小，雌雄鉴别较容易。雄鱼的蓝色条纹偏黄，间以柠檬色条纹；雌鱼的蓝色条纹偏蓝而鲜艳，间以银灰色条纹，身体比雄鱼丰满粗壮。雄鱼的体长体高比大于雌鱼的体长体高比。1.2、斑马鱼的品系资源十分丰富，目前研究中常用的斑马鱼野生型品系主要为Tuebingen品系、AB品系、WIK品系，斑马鱼基因组计划所用品系是Tuebinge此外，保存有3000多个突变品系和100多个转基因品系。1.3、个体小，发育快速，性成熟期短，繁殖能力强且易于饲养。成体长3～5cm，平均每升水可养7～0条左右斑马鱼。在合适的养殖条件下，斑马鱼的性成熟期一般为3个月左右。雌雄鱼的交配行为受光刺激，可以通过调控光周期或控制雌雄鱼的接触而控制产卵时间。一尾成熟雌鱼每周可产卵一次，一次每次可产100—300枚。由于其便于大规模养殖，可持续提供大量分析材料，因此可以用于人工诱变和突变体的筛选，成为目前唯一可以进行大规模随机诱变筛选隐性突变体的脊椎动物。1.4、卵和胚胎透明，体外受精，体外发育，易于观察。卵子比一般哺乳动物卵子大十倍，受精卵的直径约1mm，易于进行显微注射和细胞移植等操作，便于在不受损害情况下，进行细胞发育命运的连续跟踪观察和细胞谱系的分析。1.5、斑马鱼的胚胎较哺乳动物胚胎要小得多，测定需样量少。胚胎筛选可以在96孔微板上进行，每孔只需要100微升水。由于斑马鱼胚胎有可以提供营养的卵黄，因此第一周内不需要任何喂食。用药也很简单，小分子化合物可以直接溶于水中以扩散到胚胎中。1.6、胚胎学和遗传学操作技术成熟。在基因功能研究方面，已发展了转基因技术、基因过量表达技术、利用反义寡核苷酸抑制基因表达的技术、随机及靶基因定向诱变的技术、体细胞克隆技术等。斑马鱼的基因组全系列测定已经完成。1、斑马鱼在纳米生物学当中的应用。纳米生物学目前主要的研究内容是关于纳米材料的生理和生态毒性的研究。随着纳米技术的迅速发展，纳米生物学的研究得到越来越多的关注。人工纳米材料可通过直接排放、废弃物排放、常规使用等多种途径进入水环境。进入水环境的人工纳米材料可通过食物链在鱼类等水生生物体内富集并最终进入人体，对人体健康构成威胁。因此，研究纳米材料的水生生态毒性有着重要意义。目前斑马鱼在纳米生物学上的应用主要包括纳米材料对斑马鱼孵化、发育的影响，对斑马鱼组织内酶活性的影响以及一些其他的生理研究方面。2.1、探讨纳米材料对水生生物在孵化、成活率等方面的影响。如但志刚等的研究发现功能化后的碳纳米管导致斑马鱼成鱼存活率下降，作用48h的成鱼30d24 成活率下降至最低；功能化碳纳米管曝露使得虎马鱼胚胎发育异常，出现卵凝结和胚胎细胞自溶；其幼鱼延迟发育，存活率下降，甚至造成斑马鱼心包囊水肿和畸形的发生。刘红云等观察了纳米ZnO、纳米TiO2、纳米FeO、纳米Fe3O4和纳米SiO2对斑马鱼96h孵化率的影响。结果表明，纳米氧化物毒性与其成分有很大关系。纳米ZnO对斑马鱼胚胎孵化抑制作用明显，毒性较大，且其毒性与浓度之间存在一定的剂量一效应关系；在低浓度时，纳米ZnO抑制胚胎孵化的效应较等浓度Zn强，说明纳米ZnO特殊理化性质发挥了一定作用。纳米Fe2O3在低浓度下不影响胚胎孵化率，而在高浓度下抑制胚胎孵化。纳米TiO2、纳米Fe3O4、和纳米SiO2对斑马鱼胚胎96h孵化率没有明显影响。这将为各种纳米材料的应用做出指导。2.2、对人工纳米材料影响下的斑马鱼的酶系的研究探查纳米材料对水生生物的毒性。刘信勇等采用毒性试验方法研究3种质量浓度(10.0，5.0和2.5mg／L)下人工纳米材料多壁碳纳米管(MWCNTs)长时间暴露(28—35d)对斑马鱼成鱼脑和肝组织中乙酰胆碱酯酶(AchE)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH—PX)和Na，K一ATP酶活性的影响。结果表明，随着暴露时间的延长和lD(MWCNTs)的增高，AchE和GSH—PX的活性降低，Na，K一ATP酶活性呈先升高后降低的趋势。不同暴露时间的酶活性略有不同，但其趋势基本一致。比较其他试验数据，对人工碳纳米材料与酶活性进行质量浓度一效应关系分析，结果显示该试验方法制备的多壁碳纳米管悬浊液毒性较小，单独存在对水生生物危害不大。2.3、通过对纳米材料影响下斑马鱼的病变研究纳米材料的毒害机理。玉晓微等研究了不同浓度纳米二氧化硅和常规二氧化硅的水溶悬浮液对斑马鱼胚胎发育的毒性效应。结果表明，常规二氧化硅对斑马鱼胚胎发育无明显毒性效应，而纳米二氧化硅对斑马鱼胚胎发育具有明显的抑制作用，且呈一定的剂量依赖性，其对84hpf斑马鱼胚胎的LC值为240mg·L。纳米二氧化硅可导致胚胎孵化率显著下降、死亡率显著上升，且可观察到幼鱼多种畸形现象，此外纳米二氧化硅可使斑马鱼提前孵化，但提前孵化的幼鱼未发育完全。检测108hpf斑马鱼幼鱼体内丙二醛(MDA)含量发现，纳米二氧化硅染毒组MDA含量均显著高于对照组，提示，纳米二氧化硅的发育毒性可能源于其导致的氧化损伤。田文静等研究了纳米ZnO对其抗氧化酶系统的影响。结果发现，纳米ZnO能够降低斑马鱼胚胎谷胱甘肽(GSH)含量，抑制过氧化氢酶(cAT)和超氧化物歧化酶(SOD)活性，引起胚胎脂质过氧化水平增大，证明氧化应激是纳米ZnO抑制斑马鱼胚胎孵化的作用机制之一。这些研究有助于破解纳米材料的毒害机理，以进一步完善纳米科技在人类历史上的应用。1、总结24 斑马鱼是脊椎动物中最常用的模式生物，其众多的特点使其在生物研究中得到了广泛的研究。特别是斑马鱼常年产卵，鱼卵易收集，胎体透明易于观察，成本较低，可重复性好和灵敏度高等特点使斑马鱼胚胎实验在纳米材料的生态毒理效应的研究上被高度重视。斑马鱼基因的完全测定以及对其生理发育的透彻了解，让我们能够从纳米材料引起的斑马鱼病变中研究出纳米材料的生物毒害机理。纳米材料丰富的种类都有着广阔的应用前景，它们的生物效应还有待探讨和研究，而斑马鱼将在这些研究中发挥十分重要的作用。参考文献[1]周玉国,温海深.斑马鱼繁殖内分泌学研究进展[J].中国实验动物学报.2007,15(2):469-469.[2]刘昌盛,穆宇,杜久林.斑马鱼在生命科学研究中的应用[J].生命科学.2007,19(4):382-386.[3]聂芳红,刘连平.二嗯英类化合物对斑马鱼CYPIA毒理作用的研究新进展[J].广东海洋大学学报.2007,27(3):123-128.[4]王海涛.科学奇葩一斑马鱼[J].生命世界.2008,(3):22-25.[5]贾顺姬,盂安明.利用模式动物探讨出生缺陷的发生机理[J].生命科学.2006,18(2):97-100.[6]孙智慧,贾顺姬,盂安明.斑马鱼:在生命科学中畅游[J].生命科学.2006,18(5):97-101.[7]刘红云,白伟,张智勇,等.纳米氧化物对斑马鱼胚胎孵化率的影响[J].中国环境科学2009,29(1):53-57.[8]玉晓微,赵占克,韩冰,等.纳米二氧化硅对斑马鱼胚胎发育毒性的初步研究[J].生态毒理学报2009,4(5),675-681.[9]王佳佳,徐超,屠云杰,等.斑马鱼及其胚胎在毒理学中的实验研究与应用进展[J].生态毒理学报.2007,2(2):123-135.[10]全珊珊,吴新荣.斑马鱼：人类疾病研究的理想模式动物[J].生命的化学.2008,28(3):260-263.[11]郑丽丽,吴端生.斑马鱼实验动物化研究及应用[J].南华大学学报·医学版.36(2):249-251.[12]李洁斐,李卫华,王强毅,等.斑马鱼应用于毒理学研究的现况[J].实验动物与比较医学.2005,12:247-252.[13]江晓曦,等.斑马鱼：一种理想的分子生物学研究的脊椎动物模型[J].中国比较医学杂志.2004,4(14):74.24 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本科毕业设计（20__届）纳米Al2O3对斑马鱼组织结构的影响24 目　录摘　要1Abstract11前言21.1研究背景与意义21.1.1纳米氧化铝应用的高速发展21.1.2纳米材料对生态的潜在危害21.2国内外研究现状21.2.1纳米毒理学的研究21.2.2纳米氧化铝的生物效应研究31.3本课题的研究目标32材料与方法32.1材料32.1.1斑马鱼驯养32.1.2纳米氧化铝处理32.2试验方法33实验结果43.1斑马鱼死亡记录和行为观察43.2纳米氧化铝对斑马鱼鳃组织的影响43.2.1对照组鳃组织结构43.2.2实验组鳃组织结构43.3纳米氧化铝对斑马鱼肝组织的影响53.3.1对照组肝组织结构53.3.2实验组肝组织结构74分析与讨论74.1鳃组织损伤分析74.2肝组织损伤分析75结论8参考文献9致谢1024 摘　要摘要：采用浓度为0、5、10、20mg·L-1的纳米氧化铝悬液对斑马鱼进行45天的暴露实验，研究纳米氧化铝对斑马鱼肝、鳃组织的组织结构影响。H-E染色结果显示，纳米氧化铝的浓度为5mg·L-1时已经能对斑马鱼的肝组织和鳃组织产生毒害效应，其中对鳃组织的损害以防御性损伤为主，肝组织细胞出现细胞核固缩变形和细胞的大量空泡化。当浓度达到10mg·L-1时，斑马鱼所受损伤加重，表现为细胞损伤区域扩大以及受损伤细胞的比例增大。20mg·L-1纳米氧化铝对鳃组织有更加严重的直接伤害，导致鳃上皮细胞的脱落。实验表明，水环境中的纳米氧化铝的浓度为5mg·L-1时就可以对斑马鱼的肝、鳃组织造成明显有害影响。随着浓度的增加，伤害趋于恶劣。关键词：纳米Al2O3；斑马鱼；组织结构；纳米材料AbstractAabstract:Inthisstudy,Brachydanioreriowasexposedtonumbersofconcentrationsofnano-Al2O3(0、5、10、20mg·L-1)for45days,andthehistopathologicaleffectsofnano-Al2O3onBrachydanioreriogillandliverwereexaminedunderlightmicroscope.Theresultsshowedthatat5mg·L-1nano-Al2O3,thereissometoxiceffectsappeartoBrachydanioreriogillandliver.Inthiscase,thedamageofgillaretobephylacticreactions,thehepaticlesionswerecharacterizedbythehypertrophyofhepatocytesandvacuolization.Afterexposureto10mg·L-1nano-Al2O3,thedamageoflivergotworseasthedamagedzonewereenlargeandthenumberofdamagedcellsweremorethanitwhichconcentrationare5mg·L-1.20mg·L-1nano-Al2O3hadadirectdamagetothegill,whichgotthecellofthefilamentepitheliumshedding.Thiscaseshowsthat5mg·L-1nano-Al2O3candamagetheBrachydanioreriogillandliver,andthehighconcentrationoftheenvironmentitis,theworseeffectitgets.Keyword:nano-Al2O3;Brachydaniorerio;organisation;nano-material24 1前言1.1研究背景与意义1.1.1纳米氧化铝应用的高速发展纳米材料是由尺寸只有数个纳米级别的微小颗粒组成的具有特殊性能的材料。其小尺寸效应、表面效应、量子尺寸效应和宏观量子隧道效应等这些特殊的效应使纳米材料在机械、电子、医药、化工、军工等诸多领域都具有十分广泛的应用。这些特性使纳米科学已经成为当今世界上三大支柱科学(生命科学、信息科学、纳米科学)之一[1,2,3]。纳米技术可以减少原料消耗，减少污染排放，降低成本，提高性能等等优势，人们迫切需求利用其对传统工业技术进行改造。随着纳米技术的产业化，各种形式的纳米尺度的物质已经以各种不同的途径进入我们赖以生存的生态环境中[4,5,6]。氧化铝是白色晶状粉末，其中活性氧化铝被广泛地被用作化学反应的催化剂和催化剂载体，是一种多孔性、高分散度的固体材料，有很大的表面积，其微孔表面具备催化作用所要求的特性，如吸附性能、表面活性、优良的热稳定性等。通过不同的制备方法及工艺条件可获得不同结构的纳米氧化铝。其中主要的是活性氧化铝，如β-Al2O3、γ-Al2O3的比表面较大，孔隙率高、耐热性强，成型性好，具有较强的表面酸性和一定的表面碱性，被广泛应用作催化剂和催化剂载体等新的绿色化学材料。多孔性；硬度高、尺寸稳定性好，可广泛应用于各种塑料、橡胶、陶瓷、耐火材料等产品的补强增韧，特别是提高陶瓷的致密性、光洁度、冷热疲劳性、断裂韧性、抗蠕变性能和高分子材料产品的耐磨性能尤为显著。同时其极好分散，在溶剂水里面；溶剂乙醇、丙醇、丙二醇、异丙醇、乙二醇单丁醚、丙酮、丁酮、苯、二甲苯内，不需加分散剂，搅拌后即可以充分的分散均匀[4]。1.1.2纳米材料对生态的潜在危害随着纳米材料在各个领域被广泛地应用，纳米材料的生物效应引起了人们的关注。2003年4月Science、2003年7月Nature，相继发表文章，开始讨论纳米尺度物质的生物效应、对环境和健康等可能带来的潜在影响。在之后的众多研究当中，人们发现纳米材料如TiO2、碳纳米管等纳米材料对生物有一定的生理毒性。如Afaq等用支气管注入法研究超细TiO2（<30nm，用量2mg）对大鼠的毒性时，发现肺泡巨噬细胞的数量增加，同时细胞内的谷胱甘肽过氧化酶、谷胱甘肽还原酶、6-磷酸葡萄糖脱氢酶、谷胱甘肽硫转移酶的活性均升高。而且，酶活性升高并没有阻止脂质过氧化和过氧化氢的生成，这表明受到TiO2纳米颗粒作用时，尽管细胞启动自我保护机制诱导了抗氧化酶的生成，却未能消除TiO2纳米颗粒产生的毒副作用。24 随着人们对纳米材料生态效应的日益重视，纳米材料越来越多的对生物的毒副作用也被实验发现和证明。在高速发展纳米技术的同时，我们也应该考虑纳米材料对环境和健康的潜在危害。但是，这些新材料的性能很难在短时间内被完全鉴定，其生物效应如对生物世代的影响需要长期多方面的考察和研究。铝具有一定的神经毒性，对骨代谢也有明显影响，过量铝摄入可致其在器官中蓄积。铝中毒机制与铝可拮抗其他微量元素、影响一些相关酶的活力、增强铁催化自由基生成和诱发氧化损伤有关。纳米材料由于其特殊的尺寸和性能可能会有不同的毒性。1.1国内外研究现状1.1.1纳米毒理学的研究目前对纳米材料毒理学的研究尚处于起步阶段，研究多集中在SiO2、TiO2、碳纳米管、富勒烯和纳米铁粉等材料上面[2]。迄今为止的相关研究按其所用材料可以大致分为：（1）针对水生无脊椎动物（如水蚤）的生态研究；（2）针对水生脊椎动物（如斑马鱼）的生态和毒理研究；（3）针对小型哺乳动物（如小鼠等）的生态和毒理研究。大量的研究指出，大多数的纳米材料对生态有负面的影响，甚至会威胁到人类的生命健康安全[7,8]。1.1.2纳米氧化铝的生物效应研究国内外对于纳米氧化铝的生物效应研究还很少，相对于纳米氧化铝的广泛应用，其生态效应研究严重滞后[3]。但是，目前也有一些研究取得了一定的进展。如王天成等研究研究了两种粒径的氧化铝（粒径为20nm的纳米氧化铝和粒径为0.15um的微米氧化铝）对小鼠血清生化指标的影响。通过实验发现，经纳米氧化铝处理的小鼠血清中的乳酸脱氢酶（LDH）和羟丁酸脱氢酶（HBDB）与对照组相比明显降低，而微米氧化铝却没有发现该情况。这说明纳米氧化铝有着较高的渗透能力。纳米氧化铝处理组血清中碱性磷酸酶（ALP）明显高于对照组和微米氧化铝，说明其对小鼠骨代谢有一定影响。纳米氧化铝在水和各种有机溶剂中有很强的分散性，纳米材料可以通过各种途径最终进入水体。水生生态环境是地球生态环境的基础，对纳米氧化铝在水生生态环境的安全评估越来越重要，因此，亟待相关研究弥补当前参考资料的空白[3]。1.2本课题的研究目标本课题对各个环境纳米氧化铝浓度下斑马鱼生活习性进行了观察，并对其肝、鳃组织进行组织切片的对比，就纳米氧化铝的毒理做出了初步探讨。鉴于纳米氧化铝的生态效应研究的严重滞后，本课题为进一步探讨纳米氧化铝的毒性毒理研究提供资料，并为纳米氧化铝材料的进一步应用开发的生态局限提供参考。通过结合纳米材料对特定酶活力、相关基因表达等方面进行进一步的研究，可以比较完备深入地了解纳米氧化铝的毒性毒理和生态效应。2材料与方法2.1材料斑马鱼(Brachydaniorerio或Daniorerio24 )，是一种小型热带鱼。由于产卵量大、易收集、饲养简单等特点，是国际标准化组织(ISO)推荐使用的鱼类毒性试验动物(国家环保局，1990)。现已成为一些生态毒理标准(如OECD和ISO标准)的推荐测试物种。此外，斑马鱼也是研究发育生物学、分子遗传学等的理想模型，用途十分广泛[7]。由于其在生态毒理学上的广泛应用，选择以斑马鱼作为本课题的受试生物具有一定的代表性和可参考性[14,20]。本实验采用斑马鱼均购自宁波市蓝光水族馆，体长3.5cm至4cm的成鱼，雄雌约各占一半。纳米氧化铝购于杭州大洋纳米新材料有限公司，平均粒径30±5nm，白色粉末状。1.1.1斑马鱼驯养新购斑马鱼在5%的氯化钠溶液中消毒10分钟，转移至干净鱼缸中。养鱼用水为自来水滴加除氯液后曝晒2-3天。保持水温为25℃，以充气泵向水中充气以保证氧气供应，采用自然光照，每日定期给食。驯养一周后选取无异常者进行试验。1.1.2纳米氧化铝处理分别称量50mg、100mg、200mg纳米氧化铝于250ml烧杯中，加200ml水后于超声清洗机中加速分散3-5分钟。各自加入10L鱼缸中配成5mg·L-1、10mg·L-1、20mg·L-1悬液。1.2试验方法设立梯度浓度为0mg·L-1（对照组）、5mg·L-1、10mg·L-1和20mg·L-1的四组纳米氧化铝悬液，每组各加入斑马鱼20条，饲养条件同驯养期。由于定期吸出粪便及水分蒸发，使鱼缸内水量持续减少，因此每周更换一次新的纳米氧化铝悬液。饲养期间对斑马鱼行为和死亡情况进行观察和记录。暴露45天后分别对各缸斑马鱼进行活体取样，取其鳃组织和肝组织，用Bouin’s液固定。固定后样品经梯度酒精（50%、70%、80%、90%、95%、100%）脱水，由二甲苯透明，石蜡包埋。切片厚度5um，常规H-E染色，使用倒置显微镜观察拍照。24 实验结果1.1斑马鱼死亡记录和行为观察实验中，在前期（第十天左右）各组斑马鱼（包括对照组）均有1-2条死亡，这可能与整体环境有关。在其后将近50天的时间里，各组均未出现非意外死亡。暴露时间超过15天后，暴露在纳米氧化铝悬液中的斑马鱼活动量较对照组明显减少，而且对周围环境如声音和人员靠近也更敏感。这一变化在各个纳米氧化铝悬液浓度之间并无明显差异。1.2纳米氧化铝对斑马鱼鳃组织的影响1.2.1对照组鳃组织结构斑马鱼鳃的主要功能部位为鳃丝，鳃丝向两边伸出扁平囊状的鳃小片，鳃小片平行排列与鳃丝纵轴垂直。鳃丝主干包括鳃丝软骨(cartilage)、中央静脉窦(centralvenoussinus)、鳃丝上皮(filamentepithelium)。鳃丝上皮由一至两层上皮细胞组成。鳃小片由扁平细胞、柱细胞(pillarcells)、泌氯细胞等组成[3,14]。对照组受试鱼的鳃小片上皮细胞结构完整，无损伤（如图一）。1.2.2实验组鳃组织结构图一：对照组斑马鱼鳃丝切片24 实验组斑马鱼在暴露30天后，各组斑马鱼鳃组织均有观察到明显损伤，包括鳃丝上皮增厚、鳃小片呼吸上皮细胞发生肥大(hypertrophy)和水肿(edema)，伴随着鳃小片部分肿大和部分细胞空泡化。各个不同纳米氧化铝悬液浓度实验组之间均有出现以上情况（如图二至图五）。在20mg·L-1浓度中的个别切片中出现鳃小片呼吸上皮细胞的脱落。图二：实验组（30d）鳃小片顶部增生膨大500umum50um50um图三：实验组鳃组织上皮细胞水肿和空泡化图四：实验组鳃组织部分上皮明显隆起24 125umum125umum图六：实验组鳃小片呼吸上皮细胞出现水肿（星号示）和脱落（箭头示）。图五：实验组鳃小片呼吸上皮细胞水肿，伴随着鳃小片部分肿大和部分细胞空泡化。1.1纳米氧化铝对斑马鱼肝组织的影响1.1.1对照组肝组织结构正常斑马鱼肝细胞胞质均匀，细胞核呈规则圆形，位于细胞中央。对照组肝细胞如下图所示。其细胞核完整，呈圆形，核仁清晰[3]。50um图七：对照组斑马鱼肝组织切片，细胞核呈圆形，核仁被深染，清晰地位于核中心。24 125umum50um图九：实验组肝组织，细胞核固缩变形图八：实验组肝组织，细胞核固缩变形24 50um50um图十一：实验组肝组织，细胞核破裂图十：实验组肝组织，细胞核溶解250umum125umum图十三：实验组肝组织，大量细胞核偏离细胞中心图十二：实验组肝组织，部分细胞出现空泡化24 1.1.1实验组肝组织结构实验组斑马鱼的肝组织出现局部的细胞病变，就组织切片的观察而言主要表现为细胞空泡化，细胞核偏离细胞中心以及细胞核的破损，如固缩变形、破裂、溶解（如图八至图十三）。上述细胞病变在各个浓度实验组的斑马鱼肝组织中均有发现。比较各个浓度实验组之间的差异发现，5mg·L-1和10mg·L-1三氧化二铝浓度的斑马鱼组织与较高浓度实验组（20mg·L-1）相比在病变局部数量较少，病变范围也较小。而5mg·L-1和10mg·L-1两组间无明显差异。2分析与讨论2.1鳃组织损伤分析鳃是斑马鱼的呼吸器官，腮呼吸也是纳米氧化铝进入斑马鱼体内的主要途径。同时，鳃组织也是斑马鱼免疫和病理防御的前哨[18]。鱼类在水环境有毒物质作用后，使鳃组织细胞受到一系列的损伤，这些损伤可以分为两类：一是直接造成的损伤，包括鳃上皮细胞的坏死和脱落；二是防御性损伤，包括鳃丝上皮细胞肥大增生，鳃小片呼吸上皮细胞水肿等（Cengiz&Unlu，2006）。本研究中，大量的出现鱼鳃丝上皮增厚、鳃小片呼吸上皮细胞水肿等防御反应。这些防御反应可以阻碍毒物的摄入，从而延缓恶化减轻毒性效应，对鱼体有一定的保护作用。但是，防御反应降低了鳃的气体和物质交换效率，即鱼的呼吸效率，影响了鱼的循环系统，从而破坏鱼体的生理功能，影响了其新陈代谢，危及其机体健康（Liaoetal.24 ，2006）。本实验中，暴露在纳米氧化铝中悬液的斑马鱼的鳃组织大都出现包括鳃丝上皮细胞的肥大增生、鳃小片上皮细胞水肿等防御性损伤。而这种防御性损伤在各个不同浓度纳米氧化铝的实验组之间没有表现出明显差异，也即是说，5mg·L-1、10mg·L-1和20mg·L-1纳米氧化铝悬液环境下，斑马鱼鳃组织表现出相同程度上的防御性反应。防御性反应的普遍存在也说明5mg·L-1纳米氧化铝悬液已经能对斑马鱼造成了一定毒性伤害，而浓度的差异并没有使其防御反应升级。另一方面，虽然在各个实验组之间都有发现鳃丝上皮细胞的坏死和脱落，但这种直接的伤害更集中于更高浓度纳米氧化铝环境下的斑马鱼。纳米材料进入斑马鱼体内的主要途径是通过鳃的呼吸作用，即通过鳃上皮细胞进入鳃血管[19]。高浓度的纳米氧化铝环境使鳃上皮细胞中纳米氧化铝的富集作用更加明显，而细胞中纳米氧化铝的富集可能会直接对细胞造成伤害，进而出现坏死和脱落。1.1肝组织损伤分析肝脏是斑马鱼和大多数脊椎动物的解毒器官，侵犯机体的有毒异物多在肝脏中集中，所以肝脏也是毒害物质的主要靶器官之一。鱼类只有在严重中毒时才会出现类似本实验结果的肝细胞细胞核固缩症状（Gingerrich，1982），这种细胞核的固缩常伴有细胞破裂和溶解出现。而本实验中暴露在纳米氧化铝悬液中的斑马鱼的肝组织出现局部肝细胞固缩和其他的细胞核破损，但没有发现相关的细胞破裂和溶解。这可能是由于纳米氧化铝这一纳米材料的生物毒性有其特殊的毒理作用。吴玲玲等（2007）发现菲对斑马鱼的肝组织结构也有类似的影响，常常还伴有细胞的空泡化和局部的坏死[18]。细胞空泡化一般被认为是由于肝细胞内物质合成速度与向循环系统释放速度失衡而导致（Gingerich1982），也有可能是由于肝细胞中化合物含量变化如肝糖原的积累造成(Wester&Canton，1986)。值得注意的是，在鱼类受到毒物作用时，肝糖原含量通常会增加，肝组织的水含量和脂含量也会发生相应变化(Liaoeta1．，2006)，这可能是本试验中细胞空泡化地主要原因。本实验中的主要变化因子是纳米氧化铝，而空泡化是其对肝组织细胞影响的主要表现之一。肝组织是一个集消化、贮藏等多种功能的多功能器官，其代谢非常旺盛[22]。实验中暴露在纳米氧化铝中的斑马鱼的肝组织切片显示，大量的细胞核偏离细胞中心，紧贴细胞膜或角落，这不利于核基因的表达，进而降低其代谢效率，最终影响机体运行。本实验中较低浓度实验组和较高浓度实验组都有发现相同的症状，但高浓度实验组的受试斑马鱼肝组织受到更严重的损害。这说明5mg·L-1纳米氧化铝悬液在慢性毒实验中对斑马鱼肝组织已具有一定的生理毒性。联系暴露在5mg·L-1纳米氧化铝悬液中斑马鱼的鳃组织结构的变化，这中毒害影响了机体的正常运转，使其产生防御性反应。2结论研究表明，水环境中的纳米氧化铝对斑马鱼的肝组织和鳃组织有负面影响。纳米氧化铝浓度达到5mg·L-1（0.5×10-4mol·L-1）时已经能对斑马鱼的肝组织和鳃组织产生毒害效应，其中对鳃组织的损害以防御性损伤（上皮细胞肥大、水肿）为主。当浓度达到20mg·L-1（2.0×10-4mol·L-1）时，斑马鱼的肝组织受到的损伤加重，而且对鳃组织有更加严重的直接伤害（上皮细胞的坏死、脱落）。24 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