不同种属哺乳动物眼外肌周围结缔组织结构及功能初步研究硕士论文 105页

天津医科大学博士形F究生学位论文不同种属哺乳动物眼外肌周围结缔组织结构及功能的初步研究中文摘要目的研究灵长类动物与较低等哺乳类动物间眼外肌周围结缔组织形态的异同点，分析这一结构对不同种属动物，特别是对灵长类动物眼球运动机制的影响，以探讨人类眼外肌Pulley对复杂的眼球运动机制及高级视功能的作用。方法1．盐酸氯胺酮深度麻醉成年猕猴2只，成年Wistar大鼠、兔及市销家猫各5只，将所有眼眶分离，整体固定，每一动物任选一眼眶行大体解剖，组织学染色眶进行全眶石蜡包埋，冠状位连续切片，相邻切片以Masson三色染色、Weigert染色法分别进行胶原纤维和弹性纤维染色，并以鼠抗平滑肌抗体标记平滑肌。详细观察直肌周围结缔组织的形态、结构及其与眼外肌的组织关系。选取猕猴、兔及Wistar大鼠的所有切片，观察斜肌周围结缔组织的形态、结构及其与眼外肌的组织关系。2．盐酸氯胺酮深度麻醉成年猕猴1只，成年Wistar大鼠、市销家猫4只。在手术显微镜直视下行近内下侧穹窿部结膜切13，暴露内直肌整个肌腱。向后分离内直肌与眶壁间筋膜及肌间膜至可见到横跨内直肌肌腹的白色结缔组织带，此横带比较致密，用剪刀不易分离。用显微剪刀剪取靠内直肌眶侧与下直肌间厚实白色结缔1×l×lmm3白色结缔组织块。立即浸入预冷的3％戊二醛中，按常规透射电子显微镜电镜标本处理，制片，分别在不同倍放大镜下观察结缔组织各组织成分的排列形式及超微结构异同；另取相同部位结缔组织块，常规中性福尔马林固定，石蜡包埋，组织切片，相邻切片以Masson三色染色、Weigert染色法分别进行胶原纤维和弹性纤维染色。结果I\n丕鎏堕型奎兰堡主竺窒兰兰生笙塞1．在赤道部及稍后方，猕猴、猫、兔及Wistar大鼠所有直肌周围均有主要以胶原纤维组成的结缔组织环，弹性纤维散在其中，但结缔组织在眶内各部位的分布趋势不完全相同。猕猴内直肌结缔组织纤维环、内下侧(内直肌一下直肌间)连接带明显发达于其他部分；平滑肌的分布与弹性纤维在内直肌周围纤维环及内直肌一下直肌间呈明显的带状分布，其密度较其他部位明显增大。兔及猫眼外肌胶原纤维环均比较菲薄，与眶层纤维联系显得疏松；内直肌周围胶原纤维环、内下侧连接带亦不明显发达于其它纤维环或连接带；眶内平滑肌仅以极少量细胞散在分布。Wistar大鼠内直肌纤维环比其它纤维环发达，但与兔相似，平滑肌在内直肌一上直肌间连接带的分布明显发达于内直肌一下直肌间的连接带中。2．超微结构显示猕猴内直肌与下直肌间的结缔组织连接带主要以胶原纤维构成，丰富的弹性纤维、平滑肌及成纤维细胞散布于其中。相邻胶原原纤维束间紧密地以直角交错进行排列。猫及Wistar大鼠的相关结构亦主要由胶原纤维构成，其中散在分布着弹性纤维和少量成纤维细胞。猫标本中未见明显的非血管性平滑肌细胞。胶原纤维排列比较疏松，相邻纤维束间成一定角度交错排列，但非直角交错。3．在典型部位，所有直肌眶层肌纤维与胶原纤维环紧密粘连，但并非在此部位突然中止，而是有部分眶层肌纤维继续向前延伸，与胶原环间星一定间隙，并逐渐减少。4．猕猴、兔及Wistar大鼠上斜肌眶层纤维随着球层纤维向前行走，其周围结缔组织逐渐增厚直至滑车处。此后，猕猴眶层肌纤维离开球层，与胶原纤维混合存在；兔及Wistar大鼠眶层纤维随着上斜肌反折过滑车部位。三种动物上斜肌眶层周围结缔组织均与上直肌胶原纤维环相延续。5．猕猴、兔及Wistar大鼠下斜肌周围结缔组织均与外直肌、下直肌周围结缔组织相延续，但延续方式并不完全相同。在猕猴下斜肌与下直肌交叉处存在着围绕这两条眼外肌的致密胶原环，并为弹性纤维所坚固；下斜肌周围结缔组织除与其自身眶层纤维、下直肌胶原环紧密相连外，还与外直肌胶原环相延续。兔及Wistar大鼠下斜肌虽然亦有胶原结II\n墨堡垦型查兰堡主堕壅兰兰垡丝塞缔组织纤维所绕，这一包绕的胶原纤维与外直肌周围结缔组织相延续，但与下直肌纤维环较疏松地连接。结论1．灵长类眼外肌Pulley对遵守眼球运动Listing法则可能发挥了的重要作用2．灵长类内下侧Pulley带的发达可能与高度发达的集合运动及双眼视觉有关。3．并非所有哺乳动物直肌均止于胶原环，有少部分眶层肌纤维继续向前延伸并逐渐减少，提示可能并非所有眶层纤维均参与了眼外肌纤维环位置的调控。4．猕猴、Wistar大鼠及兔的上斜肌肌鞘与眶层肌纤维紧密粘连，并与上直肌周围纤维环相延续，下斜肌眶层肌纤维与其自身、外直肌及下直肌周围结缔组织相延续，提示这些EOMs问的位置相互影响，进一步解释了前庭眼反射(包括人类前庭眼反射)的部分运动机制。5．灵长类下斜肌收缩可引起下直肌内移、外直肌下移，同时伴有颞侧旋转，这可能解释了集合运动时Listing平面向颞侧倾斜的现象。关键词：服外肌；Pulley；眼球运动；Listing法则；集合；前庭眼反射；胶原纤维；弹性纤维III\n天津医科大学博士研究生学位论文Preliminarystudyonthestructure-functionrelationshipsoftheextraocularmusclesconnectivetissuesindifferentmammalsAbstractObjectivesTostudythestructureofextraocularmuscles(EOMs)connectivetissuesinprimateandotherlowermammals．Toanalyzethedifferencesofitsstructureamongdifferentspecies，andidcntifytheeffectsofthestructuresondifferentspecies’eyemovement，especiallyonhighprimateeyemovement．AndtoresearchtheroleofEOMsconnectivetissuesinhumantoeyemovementandbinocularvision．Methods1．2adultrhesus，5adultrabbits，5adultcatsand5adultWistarratswereanesthetizedwithketaminehydrochloride．Thegrossanatomyofoneofthetwoorbitsineachanimalwasobserved．Meanwhile，theotherorbitwasfixedinsituandseriallysectioned．Amurinemonocolonalantibodytosmoothmuscle(SM)．a·actinwasusedtoshowSM，whileMassontrichromestainwasusedtOshowmusclesandcollagens．andWergeitstaintoshowelastin．Analyzetheconnectivetissuesaroundrectusextraoeularmusclesdetail．Selectthesectionofrhesus，rabbitsandWistarrats，andabservetheconnectivetissuesaroundobliquemuscles．2．1adultrhesus，4adultcatsandWistarratswereanesthetizedwithketaminehydrochloride．IncisetheinferointeriorfornixCOnjunctivawithoperationmicroscope，exposethewholemedialrectustendon．Separatefasciaaroundmedialrectus(MR)musclebackward，andexposethewhiteandhardconnectivetissueringaroundit．Separatethishardconnectivetissuedownward．andexposetheconnectivetissue．Take1×1×1mm’block\n天津医科大学博士研究生学位论文ofthisconnectivetiSSUenearmedialrectusthatbetweenmedialrectusandinferiorrectusmusclewithmicroscissors．Immersethespecimeninglutaricdialdehydeimmediately．ThenprocessedthemregularlytoTEM，observetheirultrastructures，TakeanotherspecimeninthesamesiteforMassontrichromestainandWeigertstain．Results1．Inallthefourmammals，anencirclingringofconnectivetissuecircledeachEOM，locatedneartheglobeequatorinTenonfascia，andcoupledtoadjacentEOMs．Butthetendencyofconnectivetissuesamongdifferentspecieswasdifferent．Theconnectivetissue(collagenfiberandelasticfiber)ringaroundMRinrhesusisthemostdevelopedring，andthebandbetweeninferiorrectus(IR)andMRisthemostdevelopedband．Similartotheelasticfiber,theSMcellsweredistributedbybandbetweenMRandIR，andweredensestinorbit．Thecollagenringswerealsoseeninrabbitandcat．However，theyweremorethinnerandcrumblier．TheconnectivetissuesaroundMRandbetweenMRandIRwasnotbetterthanthataroundotherEOMs，andSMcellsonlyscatteredaroundtheMRwithindividualcells．TheconnectivetissuearoundMRwasthemostdevelopedamongwhicharoundfourrectusinWistarrat．ButtheconnectivetissuesbandbetweeninferiorrectusmuscleandMRwasnotbetterdevelopedthantheothers．2．TheconnectivetissuebetweenMRandIRinrhesuswasmoretighterthanwhichincatandWistarrat．Collagenmatrixwithalternatingbandsofcollagenfiberspreciselyarrangedatrightanglestooneanotherinrhesus．Elastinfibrilswereinterspersedinthecollagenmatrix．Fibtoblastsscatteredthroughouttheconnectivetissue．SMcellsweredistributedincollagen，anddidnotconnectwithotherSMcells．TherelatedstructureincatandWistarratweremainlycomprisedofcollagen．notarrangedSOtightlylikethatinrhesus．Elastinfibrils，FibroblastswereV\n天津医科大学博士研究生学位论文scatteredthroughoutthematrix．Thealternatingbandsofcollagenfiberswerearrangedsomeanglestooneanother．TherewerenomanifestSMcellswereseeninthe'sampleofcat．3．Theorbitallayers(OL)ofanyrectusextraocularmusclesdidnotendedatthemostmanifestconnectivetissuesring，butwentforwards，presentvoidbetweenitandconnectivetissuesring．4．Boththesuperioroblique(SO)sheathandtendonpassthroughthetrochlea．ConnectivetissuesaroundSOinrabbitsandratsthickenedanteriorly,reflectedinthetrochleaalongwiththeSOtendon，andbecamecontiguouswiththenasalaspectoftheSRconnectivetissuesring．RhesusSOOLinsertsonadensecollagenoussheath，whilegloballayer(GL)becomescontiguouswiththeSOtendon．TheSOsheathinsertsontheSRpulley，whilethetendonthinsandpassesinferiortotheSRpulleytoinsertonthesclera．Theconnectivetissuesaroundinferioroblique(Io)muscleinrhesus，rabbitsandratsallconnectedwiththataroundIRandlateralrectus(LR)．5．Theconnectivetissuearoundinferioroblique(10)muscleinrhesus，rabbitsandratsallconnectedwiththataroundIRandlateralrectus(LR)，butthearrangementsamongthemwerenotentirelysimilar．OnlytheconnectivetissuearoundIOinrhesusconsistedofdensecollagen，scatteredelasticfiber，andconnectedcloselylywithIR，LRPulley．Theconnectivetissuescircling10inrabbitsandratswerecrumbly,andwasnotconnectedcloselylywiththeconnectivetissuesaroundIR．Conclusions1．Thedense，densityofconnectivetissuesbandsandSMcellsbetweenEOMsinprimatehavesomedifferencetothatinothermammals，whichsuggestedthedifferenceofmechanismofeyemovementbetweenrat，cat，rabbitandprimate．TheorganizationofPulleyinprimatemayplayaimportantroleintheeyemovementListngraw，andberelatedtoVI\n天津医科大学博士研究生学位论文thedevelopedbinocularV1SlOn．2．TheconnectivetissuesbetweenMRandIRinrhesusaretight，whichprovidegreattenacitytoMRPulleyandPulleybandinrhesus．AabundantelasticfibersensureMRPulleyfineelasticityandextensibility．Thecytoarchitecturesuggestthattheyareinternallyrigidstructures．ThesecharacteristicsmaketheconnectivetissuesbetweenMRandIRinrhesusmorerefinedthanwhichincatandWistarrat．Morecomplicatedfunctionsaresuggestedwiththesestructuresinrhesus．3．TheOLofanyrectusextraocularmusclesdidnotendedatthemostmanifestconnectivetissuesring，butwentforwards，presentvoidbetweenitandconnectivetissuesring．ThismaysuggestnotalltheEOMsOLfiberscontroltheplaceoftheconnectivetissuesring．4．TheconnectivetissuesaroundSOinthreemammalsallcontinueswiththeconnectivetissuessurroundingSR，andlinkwiththeOLofSOclosely，whichshowsthecontractionofSOOLcancauseSRshiftnasally．TheconnectivetissuesaroundIOinrhesus，ratandrabbitlinkedwiththatofLRandIR．Thismayexplainthemechanismofvestibulo—ocularreflex(VOR)partly．5．TheconnectivetissuesinrhesusiSnotallsimilartothatintheothertwomammals．Inrhesus，itcloselylinkedwithOLofIO，IR，andLRPulley．InferthisstructuralcontinuationmaymakethemovementofIO，IRandLRinfluenceeachother．IRPulleymovestonasalsideandmakesextorsionwhen10contracts，whichshowsIRPulleyhassomemechanicslinkwith10，andcanexplaintherectuspulleytilttemplyincovergence．Keywords：extraocularmuscle，Pulley，eyemovement，Listing’Slaw，convergence，vestibuloocularreflex，collagenfiber，elasticfiber\n英文缩略语英文缩写英文名称cfefEOMSFbfiGLG0HGIOIRLGLPSLRMumfMiMRMRIOLONRBcollagenfiberelasticfiberextraocularmusclesfibroblastfilamentglobelayerGolgicomplexharderianglandinferiorobliqueinferiorrectuslacrimalgland中文名称胶原纤维弹性纤维眼外肌成纤维细胞细丝眼外肌球层高尔基复合体哈氏腺下斜肌下直肌泪腺levatorpalpebraesuperioris上睑提舰lateralrectusmusclemyofilamentmitochondriamedialrectus外直肌肌肉肌丝线粒体内直肌magneticresonanceimaging核磁共振成像orbitallayeropticnerveretractorbulbi眼外肌眶层视神经眼球牵缩肌\nRERSSMS0SRTrVORroughendoplasmicreticulum粗面内质网sclerasmoothmusclesuperiorobliquesuperiorrectustrochlea巩膜平滑肌上斜肌上直肌滑车vestibulo-ocularreflex前庭眼反射\n学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的论文是我个人在导师指导下独立进行研究工作取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容和致谢的地方外，论文中不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。学位论文作者签名：豳翌窿擎日期：研‘月／细学位论文版权使用授权书本人完全了解天津医科大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校向国家有关部门或机构送交论文，并编入有关数据库。保密口，在——年解密后适用本授权书。本论文属于不保密叼。(请在以上方框内打“4”)作者签名：址襁新签名：避期：∥7年f月／名\n天津医科大学博士研究生学位论文不同种属哺乳动物眼外肌周围结缔组织结构及功能的初步研究前言人类眼外肌(extraocularmuscles，EOMs)Pulley主要由胶原、弹性纤维及少量平滑肌组成，它围绕EOMs存在，接受EOMs眶层肌纤维的附着，使EOMs发生了弧形弯曲，并作为EOMs的功能起点对眼球运动发挥着重要作用。EOMs眶层肌纤维控制着Pulley的移动，调整着EOMs牵拉眼球的方向，而球层则直接牵拉眼球[1-41。正常人直立静止状态时至第二、三跟位的眼眶核磁共振成像(magneticresonanceimaging，MRI)扫描显示眼球运动过程中所有直肌的路径都相对眼球中心表现出了比较一致的弯曲IS,6】。EOMs收缩时肌肉发生屈曲的位置会轻度后移，而当EOMs松弛时肌肉屈曲的位置会轻度前移，“主动Pulley假说(activepulleyhypothesis，APH)”认为这种EOMs路径发生弯曲位置的改变是因为EOMsPulley有着活性定位，可以随着注视方向的变化发生一定的移位，从而使眼球运动可交替于大脑并一致于眼球运动的Listing法则【“91。半角法则(half-anglerule)恰如其分地为Listing法则的实现做了解释[6,9,101：头位直立且静止状态下，当扫视远处上方正中Ⅱ角度的物体时，如果从直肌Pulley和直肌巩膜附着点到眼球旋转中心的距离相等，直肌的旋转轴将正如Listing法则所要求地向后倾斜a／2角度。实际上，日常生活中头位很少处于直立静止位，有更多的时候为了精确视觉质量和扩大视觉信息范围而运用双眼集合及头位运动。集合运动和前庭眼反射(vestibulo．ocularreflex，VOR)时，MRI显示直肌Pulley围绕着视线发生了转动。头位倾斜时可引发VOR，存在着必要的代偿眼位运动，而这种运动并不遵守Listing法则。理想VOR有一个眼球旋转轴，相同于引起VOR的头位并独立于眶内眼位。VOR的EOMs速度矢量轴以\n天津医科大学博士研究生学位论文眼位改变的O％．25％发生旋转[1613]。EOMs速度轴以跟位改变的50％旋转是Listing法则的一个标准，而VOR虽然确实显示出了一个旋转轴的存在但其速度的大小却并不遵守Listing法则。这～现象显然为Listing法则所不能解释。斜肌眶层可能实现了这种转变。现在“主动Pulley假说”的重新审视提出VOR过程中Listing法则的打破是受到了斜肌的调整，其速度轴保持垂直于直肌的Listing速度轴【H】。在视觉介导的眼球运动中，斜肌的长度发生了改变f”】。直肌收缩对斜肌路径的影响最明显的是下斜肌，下斜肌PuIley一半联系于下直肌，同时其眶层也附着于外直肌Pulleyll6】。在上转位，下斜肌Pulley向前移动的距离为下直肌Pulley移动距离的一半，下斜肌旋转轴于是不再垂直于注视方向，而是保持垂直于直肌的Listing速度轴。下斜肌的作用好像是通过产生垂直于Listing平面的一个旋转速度轴以打破Listing法则[171。灵长类上斜肌眶层肌纤维附着于周围结缔组织，并随眼球运动发生一定的移动【l引。有学者推测斜肌的这种结构联系与眼球运动，尤其是与Listing法则所不能解释的VOR可能有一定的力学联系，但亦有学者认为集合时上斜肌的横断面积并未发生改变，提示末发生舒缩的变化119】。集合时双U艮Listing平面向颞侧旋转两倍于集合角的角度【201。人类眶内内下钡J]Pulley连接带远比其它连接带发达：集合运动时下斜肌变粗，下直肌内移，外直肌下移；Pulley带的平滑肌细胞于内直肌和下直肌间最丰富，集合时平滑肌的收缩可以使下直肌内移，Demer等推测这与人类复杂的集合运动是分不开的，可能是双眼视觉形成的结构基础之一【19,2H。有学者提出EOMsPulley是在哺乳动物中保守存在的组织【22，231。但有学者【24】发现Wistar大鼠的下直肌Pulley与球层肌纤维间紧密粘连，却与眶层肌纤维疏松地粘连。Felder等认为这种结构有悖于基于人类的“主动Pulley假说”所需要的EOMsPulley在眼外肌纵轴上自由地前后移动。亦有学者认为目前用以解释人类眼球运动的EOMsPulley是不存在的，自然地，所谓的“主动Pulley假说”也是不实用的[251。进化论‘26】认为动物由低级到高级的发展是长期进化的结果，视觉系统亦是随着从低等动物到高等动物的进化而逐渐复杂、完善。有人认为双眼的位置首．2．\n天津医科丈学博士研究生学位论文先取决于获得生存的需要，然后才是完成特殊的视觉任务。动物等级愈高，眼位愈向前，因而双眼偏斜角愈小，两眼视轴平行或接近平行，双眼视野愈大，甚至可获得很好的深度视觉，这种解剖结构便于较准确地攻击或追捕食物；而对于双眼轴偏离角度较大的较低等动物而言，双眼视轴的偏离使视野相应地增加，可以不需移动头部就可以环顾四周，从而提高生存的安全性，但很少有双眼视野重叠或无双眼视野重叠[27,28]。对不同动物视网膜发育的研究发现人类和猕猴有完善的黄斑中心凹发育及良好的调节功能【29】；但所有低于灵长类的哺乳动物均无明显的中心凹发育，猫虽有部分黄斑发育，但其中心凹发育仍不完善[301，Wistar大鼠仅有不完善的黄斑发育【3¨，兔的黄斑是否有发育仍处于争论期132,33]。具有中心凹注视的动物才会有双眼调节运动，同时眼调节运动有助于黄斑部中心凹注视的稳定，从而保证了视觉成像的质量【301。低等动物眼球运动目的中视觉信息的参与较少，而更重要的是参与反射运动，保证动物体位改变时眼球位置的稳定【341。对于较低等哺乳动物来说，无明显的黄斑，在功能上不属于中心凹注视，双眼视野很小，集合运动落后[27,30,35]，代偿性眼球运动(包括VOR)比随意眼球运动更重要。因此，其聚散功能及双眼视觉发育显然远非人类般复杂，但其代偿性眼球运动功能却相对显得更为重要。任何组织结构都与其功能有着必然的联系，如前所述，人类EOMsPulley对眼球运动Listing法则、VOR及集合功能和双跟视觉发挥着重要作用，但如果人类直肌Pulley这一结构在具有不同眼球运动机制的哺乳动物中高度相似地保守存在，那么它对人类发达的聚散运动、双眼视觉功能的作用显然要受到质疑。但同时，斜肌周围这一结构的保守存在却可以验证以往学者对现代VOR机制的解释。因此，我们选择了双侧外置眼的Wistar大鼠，兔子及双眼额面化但非灵长类的猫及与人类同属于灵长类的猕猴这几种哺乳动物，对其眶内EOMs周围结缔组织进行了形态学研究，以期以此为基础，进一步探讨EOMs周围结缔组织对眼球运动机制，尤其是对集合、双眼视觉及前庭眼反射的作用。\n天津医科大学博士研究生学位论文第一部分不同种属哺乳动物直肌周围结缔组织结构及功能的初步研究人类EOMsPulley由胶原、弹性纤维和平滑肌组成，它接受EOMs眶层肌纤维的附着，将EOMs相对固定于眶壁，使EOMs生了弧形弯曲，并作为EOMs的功能起点对眼球运动发挥着重要作用[I,2,31。第二注视眼位上所有直肌路径的弯曲部位相对眼球中心基本一致，从而证实了正常人EOMsPulley的立体定位14j。“主动Pulley假说”认为EOMs眶层肌纤维附着于各自Pulley结构，影响着EOMs的旋转轴；眼球运动过程中Pulley作协调的、与注视相关的前后移位【5一】。直肌Pulley的发现使眼球运动理论Listing法则被重新解释，有学者认为这一法则的实现源于外周运动系统(眼外肌及相关结构)，而不是中枢系统的控制[7-10l。然而，亦有许多学者对这一假说提出质疑。假说的结构基础直肌眶层肌纤维附着于Pulley受到质疑⋯】，甚至有相反观点认为跟球运动必须依赖于中枢神经系统的支配，所谓的EOMsPulley是根本不存在的【12】。我们选取与人类同属灵长类的猕猴来重新观察EOMs周围结缔组织的结构，以期进一步探讨EOMs周围结缔组织对眼球运动Listing法则的影响。有学者Il毛141提出EOMsPulley是动物进化过程中在守保存在于哺乳类动物的组织结构。定量分析显示人类内直肌Pulley最为发达，其与下直肌间的连接带亦为最发达的连接带[IS,16]，有学者推测这与人类复杂的集合运动是分不开的，可能是双眼视觉形成的结构基础之一【16】。但这一结论只是可能性结果，目前尚未得到多方验证。由于较低级哺乳动物双眼视轴相互偏离使其双跟视野很小，聚散运动功能不良[17,1s,19l，双眼视觉功能远非人类相关功能发达。因此，我们选取猕猴、双眼位于额面但双眼视野较小的猫类及双眼位于头部两侧的Wistar大鼠和兔，对其眶内EOMs周围结缔组织进行了形态学研究，以探讨直肌周围结缔组织对\n天津医科大学博士研究生学位论文集合运动、双眼视觉的作用。材料与方法一、材料一)实验动物成年猕猴2只，成年Wistar大鼠、兔及市售家猫各5R。二)取材盐酸氯胺酮深度麻醉至自主反射消失后将眼眶区从颅底离断，水平面与眦耳线平行，上至眶上缘上约O．5cm，下至眶下缘下约0，5era：自垂体窝中部与眶轴垂直离断，使其形成立方形组织块。所有动物随机选取一眶进行大体解剖，选取一猕猴眶自内侧眶开始解剖，取内直肌眶侧及与下直肌间连接带以各行电镜检查(具体见第三部分)。将组织学切片所用的眼眶置于10％中性福尔马林固定3．4天，用高速磨钻将骨性眶壁磨至菲薄，沿鼻中隔与视神经交叉连线将两侧眼眶分离，放入2％依地酸钠溶液中脱钙，3d更换1次溶液，至取材刀可以轻易切开为止。三)包埋将所有准备切片的眼眶脱钙后除去上下眼睑，整体固定，常规脱水至90％乙醇后沿角巩膜缘剪除角膜，用器械除去眼内晶体、玻璃体等内容物至巩膜内壁光滑。然后，继续脱水，石蜡包埋。二、制片与组织学染色全眼眶冠状位连续切片‘201，81．tm厚相邻切片行Masson三色染色和Weigert染色法分别对胶原纤维及弹性纤维染色，51xm厚切片行小鼠单克隆平滑肌a一肌动蛋白抗体标记眶内平滑肌(克隆号：1A4，NeoMarkers，USA；二抗：山羊抗小鼠IgG，Labvision，USA)。一)Masson三色染色法1．试剂配制1)Weigert铁苏木精染液甲液：苏木精无水乙醇19100ml\n圣笙垦型奎兰堡主!壅竺兰垡笙奎乙液：30％三氯化铁液4ml纯盐酸1ml蒸馏水95ml甲乙两液须分瓶盛放，甲液配制后数天即可用，不宜配制过多，保存时间过长时染色不良，平时应密封保存；乙液配制后立即可用。临用前将甲、乙两液等量混合。2)丽春红酸性品红染液：丽春红O．79酸性品红0．39蒸馏水99ml冰醋酸lml3)l％磷钼酸水溶液磷钼酸19蒸馏水100ml4)2％苯胺蓝染液苯胺蓝29冰醋酸2ml蒸馏水98ml2．染色步骤：1)组织固定于4％中性甲醛液中，常规脱水，石蜡包埋和切片。2)切片脱水3)Weigert铁苏木精液染5～lOmin。4)流水消洗5)1％盐酸一乙醇分化。6)流水冲洗5～10min。7)丽春红酸性品红液染5～10min。8)蒸馏水稍洗。9)1％磷钼酸水溶液处理约5rain。．6．\n丕堡垦型三三兰堡主!塞竺兰竺堡兰10)不用水洗，直接用苯胺蓝液复染5min。11)0．2％冰醋酸处理1min。12)95％乙醇脱水并洗去冰醋酸。13)无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。染色结果：胶原纤维呈蓝色。细胞质肌纤维和红细胞呈红色，胞核呈蓝褐色。二)Weigert染色步骤：1．试剂来源：1)Weigert’s液：SIGMA，Germany2)vanGieson液：SIGMA，Germany2．染色步骤：1)石蜡切片，脱蜡至水。2)Weigert。s液染色20分钟到1小时。3)95％酒精去除多余染液4)1％盐酸酒精分化5)水洗6)vanGieson液复染1分钟7)无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。结果：弹性纤维：蓝黑色；胶原：红色；细胞浆黄色；细胞核：蓝色。三)免疫组化操作步骤：1．抗体及试剂类型抗体名称：小鼠单克隆抗平滑肌Ct肌动蛋白抗体(克隆号：1A4)适用种属：人、狒狒、牛、兔、小鼠、大鼠及鸡检测抗原：平滑肌Ct肌动蛋白细胞着色区：胞浆来源：一抗：Neomarkeres，USA．二抗：山羊抗小鼠IgG，Labvision，USA．7．\n天津医科大学博士珂f究生学位论文显色剂：DAB2．染色步骤1)石蜡切片脱腊至水2)3％H202室温孵育5～10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。3)蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟x2(无需修复)。4)5～10％正常封闭血清(PBS稀释)封闭，室温孵育10分钟，倾去血清，勿洗。滴加一抗工作液，370c孵育1～2小时或过夜。5)PBS冲洗，5分钟×3次。6)滴加适量生物素标记二抗工作液(BiotinylatedgoatAnti-Mouse)，370C孵育10～30分钟。7)PBS冲洗，5分钟×3次。8)滴加适量的辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素工作液(streptavidinperoxidase)，37。C孵育lO～30分钟。9)PBS冲洗，5分钟×3次。10)显色剂显色3～15分钟(DAB)。自来水冲洗，复染，脱水，透明，封片。阳性结果：平滑肌细胞胞浆着棕黄色。三、图像采集仪器1．CanonIXYDIGITAL70数码照相机：CanonIne．Japan；2．OlympusBX50F4显微镜：OlympusOpticalColtd．Japan：3．Olympus摄像系统：Japan：4．HMIAS．2000高清晰度彩色医学图文分析系统：武汉千屏影像技术有限责任公司。四、图像分析选取经相同处理过程的同一种属动物眼眶切片，同时染色。在相同显微镜亮度、同一放大倍数下采用HMIAS．2000高清晰度彩色医学图文分析系统对EOMs周围及其连接带最典型的部位进行采图，测定结缔组织厚度。采用ImageProPlus5．0对结缔组织及平滑肌密度进行测量。．R．\n天津医科大学博士研究生学位论文五、统计学处理所有数据均采用；土s表示，应用SPSSl3．0R件包，对所测数据进行t检验，及单因素方差分析，后者方差不齐者采用Kruskal．Wallis秩和检验，P