动物药学毕业设计-地塞米松磷酸钠对雄性小鼠睾丸组织结构的影响 26页

河南科技大学毕业设计（论文）地塞米松磷酸钠对雄性小鼠睾丸组织结构的影响姓名孙坤杰院（系）动物科技学院专业班级动物药学091指导教师位兰2013年6月6日\n毕业设计（论文）任务书（指导教师填写）填表时间：2011年1月12日学生姓名李伟专业班级动植检072指导教师位兰课题类型论文设计（论文）题目环境水平三苯基锡对雄性SD大鼠生殖毒性的研究主要研究内容本试验以青春期SD大鼠作为研究对象，采用低水平（0.5、5、50μg/kg）的三苯基锡（Triphenyltin，TPT），进行54d的暴露，比较对照组和各浓度暴露组大鼠体重、睾丸重、附睾重、睾丸指数和附睾指数，确定TPT对睾丸发育的影响；将附睾内的精子进行涂片观察并计算精子畸形率、精子相对数；检测各组大鼠睾丸酶碱性磷酸酶（AKP）、γ-谷氨酰转肽酶(γ-GT）和总抗氧化能力（T-AOC）水平，并采用石蜡切片和HE染色技术观察各试验组睾丸和附睾组织结构的变化，以初步探讨TPT对雄性大鼠生殖的毒性作用及机理，为分析预测环境TPT污染对动物以及人类健康的影响提供依据。主要技术指标(或研究目标)1．比较试验组和对照组大鼠体重、睾丸重、睾丸指数和附睾指数；2．精子数量及其畸形率、精子相对数；3．检测大鼠睾丸AKP、γ-GT和T-AOC水平；4．通过本试验，掌握石蜡切片的制作技术；5．观察并总结染毒后大鼠睾丸和附睾组织结构变化规律；6．本项试验查阅20篇以上与本题有关的文献资料；撰写不少于1万字的论文；中文摘要400字以上，且译成外文；独立完成1万字以上印刷字符与本题有关的外语译文。进度计划2011年1月12日：下达毕业论文任务书；2011年1月12日—2月25日：查阅资料，撰写开题报告；2011年2月25日—4月30日：购买药品和材料，预实验；正式实验，数据检测分析；2011年5月1日—6月：撰写毕业论文；修改论文，预答辩。主要参考文献[1]吕华东，林麒．有机锡污染及其毒性作用研究现状[J]．海峡预防医学杂志，2007，13(03)：27-29[2]林春芳，吕华芳．有机锡的生殖毒性和遗传毒性研究进展，海峡预防医学杂志，2008，14（1）：23-25[3]詹宁育，王心如，王沭沂．辛硫磷与氰戊菊酯对大鼠睾丸的联合毒性作用[J]．中华劳动卫生职业病杂志，2001，19(4)：261-265[4]D.Annanie,黄玉瑶．氯化二丁基锡对雄性小鼠睾丸和精子质量的影响．动物学报[J]．2000,46(4):392-398[5]whalenMM,WilsonS,GleghornC,eta1.Briefexposuretotriphenyhinproducesirreversibleinhibitionofthecytotoxicfunctionofhumannaturalskillercells[J].EnvironRes,2003,92(3):2l3-220[6]GolubM,DohertyJ.Triphenyhinasapotentialhumanendocrinedisruptor[J].TaxicalEnvironHealthBCritRev.2004,7(4):281-295教研室主任签字：年月日\n地塞米松磷酸钠对雄性小鼠睾丸组织结构的影响摘要为了研究环境水平三苯基锡（TPT）对雄性哺乳动物生殖的毒性作用，本试验将20只雄性青春期SD大鼠随机分为3个不同剂量的试验组(0.5、5、50μg/kg)和1个对照组(生理盐水)。每3天灌胃一次，暴露54天，末次灌胃24h后用10%水合氯醛麻醉并处死大鼠，处死前称量每只大鼠的体重，取睾丸和附睾并称其重量，计算睾丸和附睾指数；制作精子涂片观察附睾内精子形态并统计其畸形率；采用石蜡切片和HE染色的方法观察睾丸和附睾组织学变化特点；采用分光光度法测定睾丸中碱性磷酸酶（AKP）、总抗氧化能力（T-AOC）和γ-谷氨酰转肽酶(γ-GT）水平。结果显示，TPT暴露组与对照组相比，低、中剂量组大鼠睾丸指数升高，高剂量组降低，而低、高剂量组大鼠附睾指数降低，中剂量组升高，但差异均不显著(P<0.05)；精子畸形率随药物剂量的增加显著升高；大鼠睾丸内曲精小管直径随药物剂量的增加而减小，曲精小管生精细胞和管腔内精子数量均有不同程度减少；低、中剂量组AKP高于对照组，高剂量组低于对照组，但差异不显著（P<0.05）；低剂量组γ-GT活力和T-AOC显著高于对照组，中剂量组与对照组相比变化不明显，高剂量组显著低于对照组（P<0.05）。本试验证实了TPT在一定程度上影响了大鼠生殖器官和精子的生长与发育，推测TPT对雄性哺乳动物的生殖具有毒性作用。关键词：环境水平，三苯基锡，雄性大鼠，生殖毒性文献:中华男科学,2003年二月陈蕾蕾\姚兵综述黄宇烽审校\nREPRODUCTIVETOXICITYOFENVIRONMENTALTRIPHENYLTINONMALESDRATSABSTRACTTostudytheeffectsofenvironmentleveltriphenyltin(TPT)onmammalianmalereproductivetoxicity,20healthySDadultmaleratswererandomlydividedintofourgroups.Differentdosesoftriphenyltin(TPT)(0,0.5,5and50μg/kg)wereadministratedtotheratsevery3daysfor54days.Themouseswerekilledwhentheywereanesthetizedwith10%chloralhydrateafterthelasttestsubstancegivenfor24h.Eachrat'sbodyweight,theweightoftestisandepididymiswereweighted,testisandepididymisindexwerecalculated;spermmorphologywasobservedandtheabnormalratewascalculatedbyepididymalspermsmears;thechangesofthetestisandepididymiswereobservedbyparaffinsectionsandHEstaining;thelevelofalkalinephosphatase(AKP),totalantioxidantcapacity(T-AOC)andγ-glutamylGGT(γ-GT)intesticularenzymeweredeterminedbyspectrophotometion.Comparedwiththecontrolgroup,itshowedthat,thetestisindexofratinlowandmiddledosegroupincreasedandthatinhigh-dosegroupdecreased,butepididymalindexofratsinlowandhighdosegroupdecreasedandthatinthemiddledosegroupincreased,thedifferenceswerenotSignificant(P<0.05);spermabnormalrateincreasedwithincreasingTPTsignificantly;rattestisseminiferoustubulediameterincreasedwithincreasingTPT,butseminiferoustubulegermcellsandspermdecreasedvaryingdegrees;comparedwiththecontrolgroup,thelevelofAKPintestisofratsinlowandmiddledosegroupincreasedbutthatdecreasedinhighdosegroup,thedifferencewasnotsignificant(P<0.05);thelevelofγ-GTandT-AOCintestisofratsinlowdoseincreasedsignificantly,thatinmiddledosegroupdidnotchangesignificantly,thatinhighdosegroupwassignificantlydecreased(P<0.05).ThisexperimentconfirmsTPTinfluencesratreproductiveorgansdevelopmentandspermgrowth,wepresumeTPTmayhavereproductiontoxictomalemammals.KEYWORDS:Environmentallevel，Triphenyltin，MaleRat，Reproductivetoxicity\n目录1前言11.1有机锡化合物的性质与应用11.2有机锡化合物的污染现状11.3有机锡化合物对机体的毒性作用11.4睾丸结构及精子的生成31.5睾丸标志性酶的功能31.6本试验的目的及意义42材料与方法42.1试验动物及处理取材42.2试验仪器与试剂52.2.1试验试剂52.2.2试验仪器52.3检测项目及方法52.3.1体重、睾丸、附睾、睾丸指数52.3.2精子畸形率的测定52.3.3组织学结构观察52.3.4各种生化指标的测定62.4统计学方法63结果63.1TPT暴露后SD大鼠体重、睾丸和附睾重量及其脏器指数的变化63.2TPT暴露后SD大鼠精子形态的变化83.3TPT暴露后SD大鼠睾丸和附睾组织结构的变化93.4TPT暴露后SD大鼠睾丸标志性酶的变化134讨论144.1TPT对SD大鼠生殖器官生长发育的影响144.2TPT对SD大鼠睾丸标志性酶的影响155结论16参考文献17致谢20外文资料译文21\n1前言1.1有机锡化合物的性质与应用有机锡化合物是锡和碳元素直接结合所形成的金属有机化合物。通式RnSnX4（n=1～4，R为烷基或芳香基），有烷基锡化合物和芳香基化合物两类。所有有机锡化合物都具有四价结构。在常温条件下，有机锡化合物多以固体或液体形式存在，它们一般都具有一定的极性、疏水性与难挥发性等特点，这类化合物的特殊结构与理化性质决定了他们的环境行为、生态毒理等一系列特性。随着人们对有机锡化合物研究的不断深入，其应用的领域也在不断扩大，目前已广泛应用于催化化学、药物化学、聚氯乙烯(PVC)稳定剂、防污涂料、木材及纺织品防腐剂、工农业杀虫剂和杀菌剂及日常用品的涂料和防霉剂等。在自然环境中，这些化合物与热、光、水、氧、臭氧等的作用，会迅速分解。碳元素增多其毒性降低，故三丁基锡（Tributyltin，TBT）和三苯基锡（Triphenyltin，TPT）常用于农药和渔具防污剂，增大了向环境的释入量。TPT是人造化学品，是一种重要的有机锡化合物，一般为无色或白色的固体或液体，通常几乎不溶。目前主要用作农作物杀虫剂和海洋防污涂料。1.2有机锡化合物的污染现状防污涂料的释放是有机锡进人海洋环境的直接来源，国内外大量相关的研究发现，有机锡化合物的环境污染及其分布有一定的规律，各水域之间的浓度水平有很大差别，在同一地区也不尽相同。污染严重的地区多是船只活动频繁的地区，在沉积物表层2cm内出现最大浓度，然后随深度的增加而急剧下降，之后保持平缓下降的趋势[1]。埃及Maryut湖沉积物中单丁基锡和二丁基锡与总丁基锡的比率随深度的增加而增加[2]。我国长江、黄河以及滇池、白洋淀等典型内陆水域都发现了含量较高的丁基锡化合物的存在[3]；Forsyth和Casey（2003）在加拿大7个城市的主要超市软体动物产品中发现，TBT最高可达233ng/g。来自于亚洲东海岸和东南海岸的产品中的有机锡水平最高二丁基锡(DBT)和一丁基锡(MBT)浓度分别可达88和53ng/g[4]。欧盟已经先后发布过89/677/EEC、1999/51/EC和2002/62/EC，规定：“有机锡混合物用作游离缔合的涂料中的生物杀灭剂时，不能在市场上销售。”修订案补充，“2010年7月1日起，物品中不得使用锡含量超过0.1%的三取代有机锡化合物，如TBT和TPT。”由此可见，国际上对于有机锡潜在和存在的污染是高度重视的。1.3有机锡化合物对机体的毒性作用有机锡化合物作为一种防污涂料被广泛应用于船体和海洋建筑的同时对环境的污染日趋严重，也导致海产品中残留了大量的有机锡化合物。21\n有机锡化合物可使海洋动物性成熟和繁殖推迟，性畸变，致使其性别比例失调，威胁到它们的族群生存[5]，也可干扰哺乳动物的内分泌，导致生育力下降、胚胎畸形、生长发育迟缓还可诱发基因突变、染色体畸变和DNA损伤等遗传毒性问题[6]；Groteetal.（2004）报道6mg/kgTPT影响青春期雄性大鼠的性发育[7]，林春芳等（2008）报道鱼类生命早期阶段暴露于TBT和TPT可引起胚胎发育畸形、孵化延迟或抑制、生育力下降、精子减少等生殖问题[6]；体外试验表明，TPT可以直接激活雄激素受体调节的转录，并能抑制参与类固醇激素代谢酶的活性。TPT对哺乳动物是一种生殖毒物，对人类也可能具有内分泌干扰作用[8]。对海洋的污染状况、污染来源、有机锡化物对海洋生物以及人体健康的毒性等方面的试验证明：有机锡化合物，尤其是TPT和TBT，能够引起雌性软体动物变性、哺乳细胞生殖毒性以及人类食用了含有机锡化合物的海产品后，通过食物链对人体健康可能造成极大损害，同时可以通过接触聚氯乙烯塑料制品等方式进入人体，对人体健康可能造成潜在的危险。2010年的一项调查研究发现，有机锡甚至广泛存在于人类住所灰尘中[9]。有机锡化合物一般可通过呼吸道、消化道和皮肤黏膜进入机体，影响生物的生殖功能，干扰体内激素的分泌造成生殖和遗传的不良后果[10]。TBT和TPT对昆虫、细菌、藻类等的毒性大，三甲基锡和三乙基锡对哺乳动物毒性大。研究发现，三乙基锡进入大鼠机体后，约50%能与血红蛋白结合，肝和血液的浓度最高，肾、脾、心、脑和骨骼肌较少，经口也呈类似分布。进入机体的有机锡主要经肝微粒体酶脱烷基二代谢转化，最后大部分经肾和消化道排出，本类物质也可从唾液、乳汁排出，四乙基锡还可经呼吸道黏膜排出[11]。Whalen(2003)发现短期暴露于TPT会造成人类自然杀伤细胞(NK)的细胞毒功能的不可逆抑制。他们把新鲜、独立的淋巴细胞暴露于二苯基锡(DPT)或TPT1h，然后脱离苯基锡培育6天。结果在750nMTPT下暴露1h后立即测定，发现会引起NK细胞毒功能抑制63±10%。但在暴露1h后脱离24h测定，细胞毒功能下降91±12%且6天后其抑制现象仍然存在[12]。有机锡化合物对生物体的主要损害为：中枢神经系统会造成脑白质水肿，细胞能量利用中氧化磷酸化过程受障，胸腺和淋巴系统的抑制作用，细胞免疫性受妨害，激素分泌抑制引起糖尿病和高血脂病等。对人的毒性，局部对皮肤、呼吸道、角膜的刺激作用，通过皮肤或脑水肿会引起全身中毒甚至死亡。1958年法国因用含三乙基锡的药剂治疗皮肤病而造成10%的死亡率（称为斯特利农时间）。TPT过度地暴露可能影响眼睛、免疫系统、肺、生殖系统、皮肤、咽喉和未出生的孩子，可能会导致癌症[6]。有关报道指出人类每日通过海产品摄入的TPT在0.05～0.5mg/kg21\n，而出于对人类健康的考虑，WHO规定TBT和TPT的人体日允许摄入量为1.3和0.15μg/kg体重[3]。1.4睾丸结构及精子的生成生殖是生物的基本功能之一。高等动物的生殖过程必须由雌、雄两性个体共同完成。雄性生殖功能主要包括生精、保证性行为和调节生殖功能。睾丸为雄性的主要性器官，具有生精和内分泌功能。附睾是精子浓缩、成熟、贮藏和转运的部位。在附睾内精子的形态和代谢都发生变化，变得成熟，并获得运动和受精能力。然而附睾生殖功能的实现有取决于附睾上皮细胞的吸收和分泌。睾丸是重要的内分泌器官，主要分泌雄激素和抑制素。睾丸表面覆以睾丸被膜。睾丸被膜包括鞘膜脏层、白膜和血管膜3层。白膜为致密坚硬的结缔组织，在睾丸后缘增厚形成睾丸纵隔。纵隔的结缔组织呈放射状伸入睾丸实质把睾丸分隔为多个分隔间，形成小叶隔，分隔间充满了弯曲的上皮性管道，称为曲细精管。生精小管在近睾丸纵隔处变为短而直的直精小管，直精小管进入睾丸纵隔相互吻合形成睾丸网。曲细精管周边为一结缔组织薄层，即基膜，由弹性纤维及一些平滑肌细胞构成。生精上皮是曲细精管内的主要结构，它由支持细胞和各期生精细胞组成，附着于基膜之上。生精细胞包括精原细胞、初级精母细胞、次级精母细胞、圆形精子细胞及长形精子细胞。它们依序由曲细精管的基底部向管腔排列。初级精母细胞经过第一次减数分裂形成次级精母细胞，体积比初级精母细胞小，细胞和细胞核均为圆形，核内染色质呈细网状，着色较浅，细胞质少。次级精母细胞存在时间较短，很快进入第二次减数分裂，形成两个精子细胞（圆形），染色体数目减半，成为单倍体细胞。由于次级精母细胞存在的时间短，在切片中较少见。精子细胞靠近管腔，细胞质少，核圆形，染色较深，它不再分裂，经过复杂的形态演变后形成精子。支持细胞比生殖细胞大得多，而且形态复杂，成体的支持细胞不再分裂，它们支持着整个生精上皮，附着于生精上皮的基底层，并穿过生殖细胞间伸向管腔，为精子发生提供了一个合适的环境。每一个支持细胞支持的生精细胞数目相对恒定，支持细胞的总数对最终睾丸的重量及精子产量都有影响[4]。1.5睾丸标志性酶的功能精子的发生与成熟依赖于其生存内环境的稳定、相关激素和酶类的调节。睾丸内的睾酮释放后，被选择性输送到曲细精管中，与曲细精管Sertoli细胞内的雄激素受体及管腔中的雄激素结合蛋白结合，促使精子发生和成熟[13]。机体防御体系的抗氧化能力的强弱与健康程度存在着密切联系，该防御体系有酶促与非酶促两个体系，许多酶是以微量元素为活性中心，例如：超氧化物岐化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽S-转移酶（GST）等，非酶促反应体系中主要为维生素、氨基酸和金属蛋白质。例如：VE、胡萝卜素、VC、半胱氨酸、乳铁蛋白等。这个体系的防护氧化作用主要通过三条途径：（121\n）消除自由基和活性氧以免引发脂质过氧化：（2）分解过氧化物，阻断过氧化链；（3）除去起催化作用的金属离子。防御体系各成分之间相互起到了协同作用，以及代偿作用与依赖作用[14]。碱性磷酸酶（AKP）是动物代谢过程中重要的调控酶，能够将对应底物去磷酸化，即通过水解磷酸单酯将底物分子上的磷酸基团除去，并生成磷酸根离子和自由的羟基，这类底物包括核酸、蛋白、生物碱等。而该脱去磷酸基团的过程被称为去磷酸化或脱磷酸化。它是一种非特异性磷酸水解酶，磷酸酶的作用与激酶的作用正相反，激酶是磷酸化酶，可以利用能量分子，如ATP，将磷酸基团加到对应底物分子上[15]。AKP能催化磷酸单脂的水解及磷酸基团的转移反应，对动物的生存具有重要的意义[16]。1.6本试验的目的及意义近十多年来，国内外对多种有机锡化合物对哺乳动物免疫系统的影响有很多研究[17]。Thayser(1984)最早报道有机锡化合物对哺乳动物免疫系统有抑制作用[18]。Sherman等（1988）发现高剂量三丁基锡和二丁基锡化合物引起小鼠胸腺和脾脏萎缩，小鼠体重降低；低剂量TBT对淋巴细胞功能也有抑制作用[19]。Annanie等（1988）报道TBT对小鼠免疫系统的影响，并发现氯化二丁基锡影响最大[20]。关于有机锡化合物对哺乳动物生殖系统影响的研究很少，只有Alam等（1993）报道过DBTL（二月桂酸二丁基锡）对大鼠繁殖的影响，而对哺乳动物精子影响未见报道[21]。有资料表明，由于环境污染，人类的精子质量明显下降[22,23]。但是对于环境水平下的TPT含量对雄性哺乳动物生殖的影响及机制还没有比较全面的研究报道。本试验以青春期SD大鼠作为研究对象，采用低水平（0.5、5、50μg/kg）的TPT灌胃染毒，进行54d的暴露，称量每只大鼠的体重、睾丸和附睾重量并计算睾丸指数和附睾指数，精子涂片观察附睾内精子形态并计算畸形率，采用石蜡切片和HE染色的方法观察睾丸和附睾组织学变化，用分光光度法测定睾丸中碱性磷酸酶（AKP）、总抗氧化能力（T-AOC）和γ-谷氨酰转肽酶（γ-GT）水平；以初步探讨TPT对雄性大鼠生殖机能的影响及其生殖毒性的作用机理，为分析预测环境TPT污染对动物以及人类健康的影响提供依据。2材料与方法2.1实验动物及分组处理选健康的SPF级青春期SD大鼠20只（郑州大学试验中心提供），随机分为4组：3个不同剂量(0.5、5、50μg/kg)的处理组和对照组，每组5只。各TPT处理组均用配好的浓度液灌胃，对照组给予等量溶剂（生理盐水和无水乙醇），每3日121\n次，暴露54d。末次染毒24h后用10%的水合氯醛麻醉动物，眼眶采血后处死，取双侧睾丸，称重，分别进行睾丸的形态学观察。将一侧睾丸和附睾放入多聚甲醛固定液中固定，另一侧睾丸和附睾放入-20℃冰箱中冻存用于标志性酶活性的测定。2.2试验仪器与试剂2.2.1试验试剂；苏木精，分析纯（AR），购于成都市科龙化工试剂厂，批号：20080725；伊红，分析纯（AR），购于天津市津科精细化工研究所，批号：20080727；二甲苯，分析纯（AR），购于烟台市双双化工有限公司，批号：20111116；无水乙醇，分析纯（AR），购于天津市凯通化学试剂有限公司，批号：2012-4-15；氯化钠（AR）,购于天津市凯通化学试剂有限公司；磷酸氢二钠（AR）,购于天津市凯通化学试剂有限公司;磷酸氢二钠（AR），购于天津市凯通化学试剂有限公司；中性树胶，购于上海标本模型厂，批号：20080109；即用型SABC免疫组化染色试剂盒，购于武汉博士德生物工程有限公司；多聚赖氨酸，购于武汉博士德生物工程有限公司；雄激素受体，购于武汉博士德生物工程有限公司；其余试剂均为国产分析纯试剂。2.2.2试验仪器202-1型手摇式组织切片机、OlympusBH-1型显微镜、MIE显微图像处理软件（购于山东易创电子有限公司）、101型电热恒温干燥箱、电子万用炉，单孔二列电热恒温水浴锅、电子天平、、移液枪、烤片台等。2.3检测项目及方法2.3.1组织学结构观察石蜡切片制作：取多聚甲醛固定的组织，修块后流水冲洗过夜——75%乙醇（2h）——80%乙醇（3h）——90%乙醇（2h）——95%乙醇Ⅰ（1h）——95%乙醇Ⅱ（1h）——100%乙醇Ⅰ（1h）——100%乙醇Ⅱ（30min）——二甲苯（观察透明效果）——蜡Ⅰ（1h）——蜡Ⅱ（30min）——包埋。HE染色：二甲苯Ⅰ种脱蜡10min——二甲苯Ⅱ中脱蜡5min——100%酒精Ⅰ中脱二甲苯5min——100%酒精Ⅱ中脱二甲苯5min——95%酒精中5min——85%酒精中5min——75%酒精中5min——蒸馏水中洗3min——苏木素染色5min——流水冲洗5min——0.5%盐酸分化20~40s——流水冲洗5min————流水冲洗5~10min——镜检着色满意后放入蒸馏水清洗——70%酒精5min——85%酒精5min——伊红染色2~3min——95%酒精Ⅰ5min——95%酒精Ⅱ5min——100%酒精Ⅰ中10min——100%酒精Ⅱ中5min——二甲苯Ⅰ中10min——二甲苯Ⅱ中10min——中性树胶封片。21\n2.3.2雄激素阳性灰度值测定免疫组织化学：1.载玻片用多聚赖氨酸处理以防脱片。捞片后置烤箱58---60oC,30---60min以使切片紧密粘附。2.切片常规脱蜡至水。3.3%的双氧水室温5---10分钟以灭活内源性酶。蒸馏水洗3次。4.热抗原修复：将切片浸入0.01M枸橼酸盐缓冲液（PH6.0），电炉加热至沸腾后断电，间隔5---10分钟后，反复1----2次。冷却后PBS(PH7.2---7.6)洗涤1—2次。5.滴加5%BSA封闭液，室温20分钟。甩去多余液体，不洗。6.滴加稀释50倍的一抗（小鼠IgG），37oC1.5小时。7.滴加生物素化山羊抗小鼠IgG,20---37oC20分钟。PBS(PH702----7.6)洗2分钟×3次8.滴加试剂SABC，20---37Oc20分钟。PBS(PH7.2---7.6)洗5分钟×4次。9.DAB显色：使用DAB显色试剂盒（AR1022）.取1ml蒸馏水，加试剂盒中A,B,C试剂各1滴，混匀后加至切片。室温显色，镜下控制反应时间，一般在5---30分钟之间。蒸馏水洗涤。10.苏木精轻度复染。脱水，透明，封片。显微镜观察。2.4统计学方法应用SPSS17.0统计软件处理数据，结果用平均值±标准误差（Mean±S.E.）表示。用单因素方差分析的方法进行统计学分析，组间数据的显著性检验采用Dunnet't法，以α=0.05为检验水准。3结果3.1光镜观察结果TPT暴露后，低剂量组大鼠体重显著高于对照组，中剂量组的体重低于于对照组，高剂量组体重高于对照组，但差异均不显著（P<0.05）；与对照组相比，睾丸和附睾重量均有所增加，但差异均不显著（P<0.05）（表1）。睾丸指数和附睾指数与对照组相比，低剂量和中剂量组的睾丸指数较对照组大，高剂量组较对照组减小（图1），附睾指数相比没有明显变化，统计学分析没有显著性差异（P<0.05）（图2）。21\n表1TPT暴露后SD大鼠体重、睾丸重和附睾重的变化(n=5)体重（g）睾丸重（g）附睾重（g）Control358.69±48.44a2.95±0.21ab1.05±0.05aTPT0.5μg/kg389.84±14.71a3.41±0.14a1.12±0.03aTPT5μg/kg335.96±27.98a2.89±0.07b1.10±0.04aTPT50μg/kg363.78±19.23a3.13±0.17ab1.10±0.05a注：上标没有相同字母的组间表示差异显著（P＜0.05）图1TPT暴露后SD大鼠睾丸指数的变化(n=5)上标没有相同字母的组间表示差异显著（P＜0.05）图2TPT暴露后SD大鼠附睾指数的变化(n=5)上标没有相同字母的组间表示差异显著（P＜0.05）21\n3.2地塞米松磷酸钠处理后曲精小管直径变化TPT暴露后SD大鼠的精子畸形率随暴露剂量的增加而增大，且高剂量组与对照组和低剂量组间差异显著（P<0.05）（表2、图4）。SD大鼠正常精子的结构完整，头、体、尾正常（图4-1），TPT暴露后SD大鼠的精子出现如下畸形现象：体部分叉（图4-2）、无尾（图4-3）、颈部膨大（图4-4）、弯颈（图4-5）、前钩变形（图4-6）、无头（图4-7）、多个相连（图4-8）、头颈折转（图4-9）、头尾相连（图4-10）、尾部弯曲（图4-11）。表2TPT暴露后SD大鼠附睾精子畸形率的变化(n=5)样本数观察精子数畸形率（%）Control5100019.89±0.23aTPT0.5μg/kg5100022.63±0.14aTPT5μg/kg5100027.42±0.31abTPT50μg/kg5100030.27±0.40b注：上标没有相同字母的组间表示差异显著（P＜0.05）图3TPT暴露后SD大鼠精子畸形率的变化(n=5)上标没有相同字母的组间表示差异显著（P＜0.05）21\n图4伊红染色的附睾精子照片正常精子(1)和不正常的精子（2～11）：（2）体部分叉；（3）无尾；（4）颈部膨大；（5）弯颈；（6）前钩变形；（7）无头；（8）多个相连；（9）头颈折转；（10）头尾相连；（11）尾部弯曲。3.3地塞米松磷酸钠对雄激素分泌的影响光镜下对HE染色后观察到睾丸和附睾组织病理变化为：低剂量处理组SD大鼠睾丸曲精小管直径高于对照组，中剂量组和高剂量组均小于对照组，且高剂量组更明显，有严格的剂量依赖性但统计学分析差异不显著（P<0.05）（图5）。对照组睾丸精曲小管结构清楚，被膜正常，结构完整，管腔大小一致，支持细胞、生精细胞排列规整，各级生精细胞由外到内依次为精原细胞、初级精母细胞、次级精母细胞、生精细胞、精子，并且分化良好，腔内可见较多成熟精子。支持细胞呈不规则的高柱状或锥状，细胞底部附着在基膜上，顶部伸达腔面。睾丸间质疏松，组织正常，血管周围可见散在的间质细胞，细胞较大，呈圆形或不规则状，核圆形（图6A1、A2）；21\n染毒组大鼠睾丸组织均有不同程度的损伤，主要表现为曲细精管内大量生精细胞坏死，细胞核固缩凝聚，并出现空泡样结构。具体为：低剂量组大多数曲细精管排列正常，基膜正常，支持细胞正常，少数曲精小管的各级生精细胞数目减少；中剂量组大多数曲精小管排列正常，少数稀疏，间质较正常组增宽，各级生精细胞数目减少，管腔内精子数减少；高剂量组曲精小管排列稀疏，间质较正常组明显增宽，部分基膜脱落，曲精小管的各级生精细胞数目呈不同程度的减少，严重时只有一层，管腔内精子数明显减少（图6B1～D2）。对照组大鼠的附睾管排布紧密，腔内精子丰富，分布均匀，管周结缔组织丰富（图6a）；TPT处理组出现生精上皮变薄，少数管腔细胞排列紊乱，间隙增大，输出小管、附睾管上皮明显变薄，细胞减少，管间疏松，间隙增大的现象，损伤程度随着处理剂量的增加而逐渐加剧，呈现剂量依赖效应（图6b～d）。图5TPT暴露后SD大鼠曲精小管直径的变化(n=5)上标没有相同字母的组间表示差异显著（P＜0.05）21\n21\n图6TPT暴露后SD大鼠睾丸和附睾组织结构照片A1、A2为对照组睾丸图片；B1、B2为低剂量组睾丸图片；C1、C2为中剂量组睾丸图片；D1、D2为高剂量组睾丸图片；a为对照组附睾尾图片；b为低剂量组附睾尾图片；c为中剂量组附睾尾图片；d为高剂量组附睾尾图片21\n3.4TPT暴露后SD大鼠睾丸标志性酶的变化TPT暴露后，比较各暴露组与对照组标志性酶结果（表3）可发现，低剂量组大鼠睾丸γ-GT活力较对照组显著增高，高剂量组大鼠睾丸γ-GT活力较对照组显著降低，中剂量组与对照组无显著差异（P<0.05）（图7）。低剂量组大鼠睾丸T-AOC较对照组显著增高，高剂量组大鼠睾丸T-AOC较对照组显著降低，中剂量组与对照组无显著差异（P<0.05）（图8）。高剂量组大鼠睾丸AKP较对照组低，低、中剂量组较对照组没有明显变化，统计学分析均无显著差异（P<0.05）（图9）。表3TPT暴露后SD大鼠睾丸标志性酶的变化样本数γ-GT(U/gprot)T-AOC（U/mgprot）AKP(U/gprot)control553.93±8.73a1.84±0.13a134.23±23.69aTPT0.5μg/kg597.02±14.82b2.69±0.16c143.71±19.90aTPT5μg/kg559.35±3.67a1.61±0.24a147.43±14.70aTPT50μg/kg534.87±2.11c0.74±0.14b107.72±10.54a注：上标没有相同字母的组间表示差异显著（P＜0.05）图7TPT暴露后SD大鼠睾丸γ-谷氨酰转肽酶活力的变化(n=5)上标没有相同字母的组间表示差异显著（P＜0.05）21\n图8TPT暴露后SD大鼠睾丸总抗氧化能力的变化(n=5)上标没有相同字母的组间表示差异显著（P＜0.05）图9TPT暴露后SD大鼠睾丸碱性磷酸酶的变化(n=5)上标没有相同字母表的组间示差异显著（P＜0.05）4讨论4.1TPT对SD大鼠生殖器官生长发育的影响有资料报道，在1.4～20mg/(kg·d)的剂量范围内，TPT就能对大鼠生殖功能和形态产生不良影响。较高剂量时，睾丸和卵巢组织均发生病理学变化，并能导致大鼠不育[5]。体重是综合反应动物全身健康状况的最基本指标之一。本试验中，随着TPT21\n剂量的增加，雄性大鼠体重先升高后降低。染毒组体重的变化说明低剂量的TPT对大鼠生长有促进作用，而高剂量的TPT对大鼠的生长会产生抑制作用。动物在不同年龄段，其脏器系数值有一定规律[24]，当受到有害物质影响时，该比值将发生改变。本试验中，低剂量和中剂量组的体重及睾丸系数较对照组大，高剂量组低于对照组；附睾系数变化不明显。精子发生包括从精原细胞到精子形成这一连续增殖分化的过程，对有害因素的作用十分敏感，环境化学物可在不同的阶段干扰精子的发生过程。因此，评价精子的数量、活动能力和形态可以反映环境因素对雄性生殖最终的毒性效应，是雄性生殖毒性评价不可缺少的观察终点[25]。足够的精子数量是维持正常生育力的重要前提，精子数量的减少常常是各种化学物质对各级生精细胞生长与发育产生毒性作用的结果。精子运动是精子通过雌性生殖管道到达受精部位所必需的，被认为是生育力最有预测性的指标之一[26]。精子形态是评价化学物质对精子遗传物质产生不良的潜在性影响的间接指标[25]。精子形态的改变反映雄性生殖细胞的遗传损伤，精子畸形率的高低，可反映该化学毒物的生殖毒性和对生殖细胞潜在的致突变性[27]。精子数量和活力的变化是反应雄性生殖异常的早期指标，精子数量减少将导致雄性不育，精子头畸形率增高将导致雌鼠受孕率下降和子代畸形率增加。本试验结果显示暴露组大鼠附睾内精子的畸形率呈上升趋势，并且与TPT剂量有严格的依赖性，精子数量随着药物剂量的增加明显减少，表明TPT干扰精子正常生长与成熟，对精子生成具有潜在的不利影响。睾丸曲细精管的支持细胞有多种功能，包括支持营养生精细胞，参与血一睾屏障的形成，分泌少量液体，有助于精子的运动等，而各级生精细胞是精子形成的前提。本试验结果表明，随着TPT染毒剂量的增加，曲精小管萎缩，间质不同程度的增宽，各级生精细胞减少，管腔内精子数降低，部分管腔内精子缺失。有研究报道[28-31]，有机砷、有机铅和有机汞等有机金属化合物对小鼠精子的毒性很强，能明显降低小鼠精子质量。氯化二丁基锡能引起小鼠睾丸萎缩，降低精子质量，毒性强度与有机金属化合物相似。其影响机理可能与该化合物抑制试验动物的生殖生理功能、酶系活性以及破坏生殖系统结构有密切关系[32]。因此推测TPT产生毒性效应的作用机制之一可能是TPT透过血睾屏障而作用于生精细胞，雄性生殖器官是TPT毒性作用的主要靶器官，影响睾丸正常的生精过程，从而干扰精子的生长、发育和能量代谢过程。4.2TPT对SD大鼠睾丸标志性酶的影响精子发生需要经历一系列复杂的变化过程，每个阶段都依赖于能量的供应。由于酶的催化是能量产生不可缺少的重要条件，因此正常的精子数量和质量有赖于生精过程中各种酶活性的维持[33]21\n。阐明化学物质对睾丸各类细胞标志酶的影响，有助于解释靶细胞的定位和精子发生障碍的机制[34]。AKP主要存在于精原细胞、胚胎期初级精母细胞及各级生精细胞与支持细胞的交界面上，参与睾丸生殖细胞增殖、分裂与分化时的营养物质的运输，生精细胞的分裂活动密切相关、并参与营养物质向各级生精细胞的转运，AKP活性下降势必干扰各级生精细胞的营养和能量供应[35]，其活力在精原细胞和早期发育时期的初级精母细胞较强[36]。本试验结果显示，各暴露组AKP的活力与对照组相比变化不明显。γ-GT是睾丸支持细胞的特异标志酶，主要存在于支持细胞上，它的活性与支持细胞的功能息息相关[37]。支持细胞在精子发生过程中具有提供营养、支持和保护的作用，有利于生殖细胞顺利发育成为成熟的精子，γ-GT活性的降低表明支持细胞机能受到了损伤[38]。本研究结果表明，低剂量暴露组γ-GT的活力出现代偿性升高，高剂量组明显降低，说明高剂量组对支持细胞受到了严重损伤。抗氧化物是指与可氧化的底物相比以低剂量存在时，能显著地延缓或阻止对底物氧化性损伤的物质。正常机体内存在一套有效的抗氧化防御系统，可以清除氧自由基及其代谢产物。组织T-AOC既可以反映机体清除氧自由基的能力，也容易测其含量[39]。低剂量处理组大鼠睾丸T-AOC较对照组高，中、高剂量组大鼠睾丸T-AOC低于对照组。通过以上睾丸内酶含量的变化，表明TPT干扰了各级生精细胞的能量代谢过程，导致精子的发育和成熟过程中能量供应障碍。这些酶活性的变化可能与本试验所观察到的生精过程受损（精子畸形率增加、数量减少）存在着一定关联。5结论本试验通过对不同剂量TPT暴露后SD大鼠的睾丸指数、附睾指数、精子形态、生殖器官组织形态和标志性酶水平变化的研究，显示了中、高剂量（5、50μg/kg）TPT影响了睾丸正常的生精过程，干扰了精子的生长、发育和能量代谢过程，导致大鼠精子数量和活度下降，精子畸形率增加，对雄性大鼠的生精功能已经产生了损害作用，提示TPT对雄性哺乳动物的生殖具有毒性作用。21\n参考文献[1]刘稷燕，江桂斌，徐明德．南极长城湾附近和台湾以南部分海域水样中丁基锡化合物分析[J]．环境科学学报，2002，22(2)：267－269[2]全燮，陈硕．有机锡污染物在海洋沉积物中的迁移和转化[J]．海洋环境科学，1995，14(4)：2l－26[3]江桂斌，刘稷燕，周群芳，等．我国部分内陆水域有机锡污染现状初探[J]．境科学学报，2000，20(5)：636－638[4]PaulSCooke,DeniseRHolsberger,RaphaelJWitorsch,etal.ChapinThyroidhormone,glucocorticoids,andprolactinatthenexusofphysiology,reproduction,andtoxicology[J]．ToxicologyandAppliedPharmacology,2004,194:309-335[5]宋美芳，李杰．有机锡的污染及其生殖毒性［J］．环境与职业医学，2005，22(6)：549－551[6]林春芳，吕华芳．有机锡的生殖毒性和遗传毒性研究进展，海峡预防医学杂志，2008，14(1)：23－25[7]GroteK,StahlschmidtB,TalsnessCE,etal.Effectsoforganotincompoundsonpubertalmalerats[J].Toxicology,2004,202:145-158[8]GolubM,DohertyJ.Triphenyhinasapotentialhumanendocrinedisruptor[J].TaxicalEnvironHealthBCritRev.2004,7(4):281-295[9]ForsythDS,CaseyV,Butyhincompoundsinretailmolluscproducts[J].FoodAdditivesContaminants,2003,20(5):445-452[10]夏元洵．化学物质毒性全书[M]．上海：上海科学技术文献出版社，1991，106[11]吕华东，林麒．有机锡污染及其毒性作用研究现状[J]．海峡预防医学杂志，2007，13(03)：27－29[12]whalenMM,WilsonS,GleghornC,eta1.Briefexposuretotriphenyhinproducesirreversibleinhibitionofthecytotoxicfunctionofhumannaturalskillercells[J].EnvironRes,2003,92(3):2l3-220[13]葛秦生．临床生殖内分泌学[M]．北京：科学技术文献出版社，2001，789[14]许立，刘晓晖，张莉．人参总皂苷对小鼠睾丸NO、NOS及总抗氧化能力的影响[J]．2006，9：15－25[15]王秋颖．碱性磷酸酶特性及其应用的研究进展中国畜牧兽医．2011，38(1)：157－160[16]张辉，张海莲．碱性磷酸酶在水产动物中的作用．河北渔业[J]．2003，131(5)：21\n12－14[17]NicoteraF.MPierluiguiTributyltinstimulatesinratsthymocytes.Biochem,Biophy.1990,283(1):46-50[18]ThayerJSOrganotinCompoundsandLivingOrganisms1984.NewYork:AcademicPress.Incectivenessofthecompoundsagainstleukemia.App.Organomet.Chem.1988,2(01):65-72[19]PenninksAH.WSenein.VKriekenToxicityoforganotincompounds:Suppressionofthymus-dependentimmunityinratbydibutyltindichlorideanddioctyltindichloride.Toxicol.App.Pharmacol.1977,42(03):213-224[20]D.Annanie,黄玉瑶．氯化二丁基锡对雄性小鼠睾丸和精子质量的影响．动物学报[J]．2000,46(4):392－398[21]AlamMS.RHusain.PKSeth.SPSrivastavaAgeandsexrelatedtobehavioralchangesinducedbydibutyltindilaurateinrats.Bull.Environ.Contam.Toxicol.1993,50(02):286-292[22]OsmondJDC.GPhalguni.UFatihSpermicidalactivityofmetallocenecomplexescontainingvanadium(Ⅳ)inhumans.Biol.Reprod.1998,58(05):1515-1526[23]MartinaP.KKristaEffectofleadonreproductioninmalemice.Bull.Enuiron.Contam.Toxicol.1987,39(03):448-452[24]孙敬方．动物实验方法学[M]．北京：人民卫生出版社，2001：250－251[25]CuritisD.Klaassen．毒理学：毒物的基础科学[M]．人民卫生出版社，2004，605[26]黄勤，黄幸纾．工业品六六六对小鼠精子影响的研究[J]．浙江医科大学学报，1987，16(1)：9[27]许重洁，张艳芬，杨保胜，等．阿霉素对雄性小鼠生殖毒性影响的研究[J]．现代预防医学，2010，37(10)：1923－1927[28]HironobuTS.KShogo.HidekiI.TetsuyaKYukihishaKYasuoandTSouichiEffectsofmaternalexposuretosixheavymetalsonfetaldevelopment.Bull.Environ.Contam.1987,38(04):580-587[29]JenaldR.C.DKS.MurthyEmbryo-andfetotoxicityofchromiumingestationallyexposedmice.Bull.Environ.Contam.Toxicol1996,57(02):327-334[30]KirubangranR.KPJoyToxiceffectsofmercuricchloride,methylmercuricchloride,andemisan(Anorganicmercurialfungicide)onovarianrecrudescenceinthecatfishClariasbatrachus.Bull.Environ.Contam.Toxicol1988,39(04):448-452[31]RobbGW.RPAmannDailyspermproductionandepididymalspermreservesofpubertalandadultrats.[J].Reprod.Fert.1978,54(01):103-10721\n[32]FishRHBioorganotinchemistry:Metabolismoforganotincompoundsinmicrosomalmonooxygenasesystemsinmammals.[J].Agric.FoodChem.1977,25(01):1-6[33]PadungtodC,SavitaDA,OverstreetJW,etal.SpermaneuplodyamongChinesepesticidefactoryworkers[J].ScoringbytheFISHmethodjamjindmed.1999,36:230-238[34]文一，魏帅，潘家荣．毒死蜱对雄性大鼠生精功能的影响，农药[J]．2008，47(8)：595－600[35]江泉观，于永强主编．雄(男)性生殖毒理学——理论与方法[M]．北京：北京医科大学和中国协合医科大学联合出版社，1994，225－245[36]季宇彬，蒋晖，郎朗，等．甲苯二异氰酸酯致小鼠睾丸脂质过氧化损伤及标志酶活力的变化[J]．毒理学杂志，2005，19(3)：225－226[37]詹宁育，王心如，王沭沂．辛硫磷与氰戊菊酯对大鼠睾丸的联合毒性作用[J]．中华劳动卫生职业病杂志，2001，19(4)：261－265[38]张纪亮．有机锡对褐菖鮋性腺发育和胚胎发育的影响[D]．厦门大学：环境化学，2009，10：104－105[39]李世文，郑新民，郑航，等．一氧化氮、总抗氧化能力对大鼠隐睾生殖细胞凋亡的影响[J]．中华男科学，2003，9(3)：175－17721\n致谢岁月匆匆，我的论文即将完成，我的大学生活也将随之结束。此刻，我是无比的激动，心中充满了喜悦。在此论文撰写过程中，要特别感谢我的导师——位兰老师。从论文的选题到搜集资料，从开题报告、实验、写初稿到反复修改，期间无时不有位老师的精心指导，无不倾注着导师的汗水和心血。感谢她的谅解与包容，没有位老师的帮助也就没有今天的这篇论文。感谢张纪亮老师和司丽芳老师在实验中给予的指导与帮助，感谢实验组的所有同学，在实验中我们互帮互助，才有了最终的结果。求学历程是艰苦的，但又是快乐的。感谢四年里与我朝夕相处的舍友，你们是我人生中最大的一笔财富。感谢你们在这四年的大学生活中对我的关心照顾，理解和帮助。感谢四年里我的所有老师，您们的谆谆教诲我将铭记于心。谢谢我的父母，没有他们辛勤的付出也就没有我的今天，在这一刻，将最崇高的敬意献给你们！本文参考了大量的文献资料，在此，向各学术界的前辈们致敬！李伟2011年6月6日21\n外文资料译文21