流式细胞术临床检测项目操作流程 16页

流式细胞术临床检测项目操作流程临床检测项目操作流程1:淋巴细胞亚群测定2：HLA-B27测定3：CD55/CD59测定4：血小板抗体测定5：红细胞抗体测定6：粒细胞抗体测定7：白血病免疫分型测定&淋巴细胞T细胞亚群细胞内因子IFN-y/IL-4测定9：XL操作步骤淋巴细胞亚群测定（CD系列）方法流式细胞仪（BD）原理：双/三色直接免疫荧光法。荧光素标记的各种单克隆抗体加入到全血中,与口细胞膜上相应的抗原结合，经过溶血、洗涤（和固定）等步骤后，在 流式细胞仪上进行分析，从而得到淋巴细胞亚群的百分数。淋巴细胞表面抗原分布如下：T淋巴细胞：CD3+；B淋巴细胞：CD5+,CDI9+；辅助性T淋巴细胞:CD3+CD4+；抑制性T淋巴细胞:CD3+CD8+；NK细胞: CD3・CDI6+56+等。根据淋巴细胞膜上CD分子表达的不同，流式细胞仪可以分辨出淋巴细胞及其各种不同的亚群，利用计算机软件计算出淋巴细胞亚群的百分数。标本采集与处理受检者的准备：检查对象生活饮食处于日常状态，空腹静脉采血。抗凝剂：EDTA或肝素抗凝血要求：1.样木量至少1ml。2•样本应在采集后6小时内处理，冷冻的标本不能用。3•样本口细胞计数应在4.0-10.0X109/L之间。若>10.0X109/L,样 本需耍稀释，用PBS稀释；若<4.0X109/L,4•溶血样本不能用。试剂品牌贝克曼库尔特成分1：单克隆抗体2：全血溶血试剂A：甲酸B：碳酸钠等C：多聚甲醛3：鞘液4：清洗液应分离单个核细胞。规格1ML70ML32ML14ML20L5L贮存2—8°C室温室温室温室温室温 质控品BD产品，未开瓶的试剂于2・8°C保存，可在有效期内保持稳定，稀释的试剂于2・8°C可稳定2周；每天校准一次：遇特殊情况随时进行校准。样本制备：1）按照要求，分别向已编好号的试管中加入20ul单克隆抗体和同型对照2）分别向试管中加入混匀的100U1抗凝血。3）混匀，避光，室温孵育20-30分钟。4）溶血:FACSLYSINGSOLUTION（按说明书步骤溶血）。5）上机测样（可根据样本情况选择洗或不洗上样。操作性能精密度批内五次重复CV<2%灵敏度500—1000个荧光素分子参考值（百分数（绝对值））CD3+60.8-75.4%（1141-1880）CD4+29.4-45.8%（478-1072）CD8+18.2-32.8%（393-742）NK9.5-23.5%（175-567）Th/Ts1.05-2.03临床意义l.T、B淋巴细胞亚群是重耍的免疫状态检测指标，在肿瘤、免疫缺陷、病毒感染，自身免疫性疾病、创伤、急性感染、多脏器功能衰竭、器官移植等具有临床诊断、病情判断、治疗等价值。 临床常用Th/Ts比值來判断病人的免疫状况。Th/Ts比值升高：表示免疫功能亢进：见于自身免疫性疾病，如SLE、类风湿性关节炎、自身免疫性溶血性贫血、重症肌无力以及HBsAg+乙肝等。Th/Ts比值减低：表示免疫功能下降：艾滋病、病毒感染、肿瘤病人、慢活肝和活动性肝硬化、再生障碍性贫血、粒细胞减少患者。2：NK细胞主要破坏各种肿瘤细胞和感染某些病毒、细菌的细胞，所以在抗肿瘤和防御疾病中起主要作用。NK活性减低主要见于各种恶性肿瘤、口身免疫性疾病、病毒感染、应用免疫抑制剂，疲劳综合征病人等，NK活性随年龄增长而减退。NK细胞也参与第二型超敏反应和移植物抗宿反应,白介素・2治疗后；外周血NK细胞增加。HLA-B27测定原理：双色直接免疫荧光法。将HLA・B27・FITC/B7・PE单克隆抗体加入到全血中，与白细胞膜上相应的抗体结合，经过溶血、洗涤（和固定）等步骤后，在流式细胞仪上进行分析，测定HLA・B7阴性而HLA-B27阳性细胞的平均荧光强度和所占的百分比。样本制备：1）按照耍求，分别向已编好号的试管屮加入20ul单克隆抗体和同型对照2）分别向试管中加入混匀的100U1抗凝血。 3）混匀，避光，室温孵育20-30分钟。4）溶血:FACSLYSINGSOLUTION（按说明书步骤溶血）。5）洗、离心、上机测样（备注：测B27-定要至少洗一遍方可上机检测）报告结果报告阴阳性参考值阳性：HLA-B27阳性而HLA・B7阴性细胞的平均荧光强度在8.0以上。临床意义HLA复合体位于第6号染色体的短臂上，该区DNA片段长度约3000-4000KB,占人体整个基因的1/3000,HLA-B27是HLA・I类基因中B位点上的一个等位基因，与多种疾病具有相关性，尤其是强直性脊柱炎。CD55/CD59测定原理：双色直接免疫荧光法。近年的研究表明，红细胞和白细胞膜上CD55和CD59分子的表达量和缺乏表达细胞的数量对PNH诊断和鉴别有重要意义。血细胞（红细胞和白细胞）通过膜上的抗原分子与荧光素标记的CD55或CD59的多克隆抗体结合。用流式细胞仪检测CD55或CD59表达阳性细胞百分数。样本制备：（一）白细胞CD55/CD59检测1•准备2支流式细胞仪专用管，分别标记。分别向二管中加入样品lOOulo2.溶血。 3•离心后分别加入CD55/CD5910ul和相应的同型对照10ul。避光20・30分钟。4.洗涤离心5.上机测样（二）红细胞CD55/CD59检测1•准备2支流式细胞仪专用管，分别标记2.分别加入CD55/CD5910ul和相应的同型对照10uL3.向二管中加入1：200稀释的样品100ul（可根据红细胞的数量调整），避光20・30分钟。4•洗涤离心。5•混匀、上机测样。报告结果报告百分数参考值CD55>97%CD59>97%PNH的临界值：RBCCD59>95%WBCCD59>90%PNH的诊断值：RBCCD59>91%大部分>80%屮性粒细胞CD59>84%临床意义用于AA和PNH的诊断和分型诊断。PNH时CD55和CD59明显减低和缺如。血小板膜表面抗体测定 原理：直接免疫荧光法。FITC标记的各型多克隆抗体，加到经离心富集的血小板中，与血小板膜上的相应的lgG・Fc片段结合，经过洗涤（和固定）等步骤后，在流式细胞仪上进行分析。操作：富集血小板法：1）800r/min*15minz取上清，2）加4—5ml鞘液,2000r/min*3min,弃上清，重复一次。3）分别向己编好号的试管屮加入10ul单克隆抗体和同型对照（IgG-FITC）4）分别向试管中加入准备好的10ul含血小板的PBS（血小板的量约为106）（血小板若在正常范围，稀释到原量直接取lOulo）o5）混匀，避光，室温孵育20-30分钟6）洗或不洗，上机测样全血法：1）加4—5ml鞘液，1500r/min*15min,弃上清,后同上3）—6）报告结果报告百分数参考值lgA<2.98%lgG<3.04%lgM<3.0% 临床意义为免疫性血小板减少性紫瘢（ITP）诊断、治疗、预后估计的重耍指标，在ITP、胶原性疾病时升高。红细胞膜蛋口结构测定（红细胞抗体）原理：直接免疫荧光法。FITC标记的各型多克隆抗体，加到全血中，与红细胞膜上的相应的IgG-Fc片段结合，经过洗涤（和固定）等步骤后，在流式细胞仪上进行分析。操作：1）按照耍求，分别向己编好号的试管中加入10ul单克隆抗体和同型对照（IgG-FITC）2）分别向试管中加入混匀的100ul抗凝血（1：200稀释后）。3）混匀，避光，室温孵育20・30分钟4）上机测样报告结果报告百分数参考值lgA<2.78%lgG<2.98%lgM<2.52%lgD<2.88%临床意义自身溶血性贫血的分型诊断粒细胞抗体测定原理：直接免疫荧光法。FITC标记的各型多克隆抗体，加到经溶血处理后的 样本中，与粒系胞膜上的相应的IgG-Fc片段结合，经过洗涤（和固定）等步骤后，在流式细胞仪上进行分析1）溶血2）分别向已编好号的试管中加入10ul单克隆抗体和同型对照（IgG-FITC）3）分别向试管中加入经溶血处理得样本lOOulo4）混匀，避光，室温孵育20・30分钟,洗涤离心5）上机测样报告结果报告百分数参考值lgA<2.68%lgG<2.66%lgM<2.49%lgD<3.4%临床意义白细胞减少症的分型诊断，大多数白细胞减少症患者抗体为阳性白血病免疫分型测定原理：三色直接免疫荧光法。正常血细胞的分化成熟过程中，细胞膜、细胞浆有抗原的表达与血细胞的分化发育阶段密切相关，因此这些抗原的表达 与否可作为鉴别细胞和其分化阶段的基础。利用荧光素标记的单克隆抗体对血液或骨髓进行染色，通过FCM对白血病细胞细胞膜和细胞浆抗原进行分析，由此了解所测白血病细胞的系列属性及其分化程度。三色染色在白血病免疫分型中较为常用。根据分型需要，选择相应抗原的标记抗体，一般FITC标记抗体和PE标记抗体搭配为一组，再加PC5标记抗原CD45单克隆抗体，共三种抗体加入一管标本采集与处理受检者的准备检查对象生活饮食处于日常状态，腰穿采骨髓。抗凝剂肝素抗凝要求1.样本量至少3mlo2.样本应在采集后6小时内处理，冷冻的标本或已固定的标本不能用。3.样本白细胞计数应在4.0-10.0X109/L之间。若>10.0X109/L,样本需耍稀释，用PBS稀释；若<4.0X109/L,应分离单个核细胞。4•溶血样本不能用。操作■样本制备：细胞膜表面抗原1・首先准备所需的管，并在管上标记上欲加入的抗体。2.首先每管中加入5ulCD45-PC5抗体。3.然后，按管上的标记，加入相应抗体各10ul（注意：必须是FITC和PE标记的抗体搭配）4.各管中加入标本（骨髓或外周血）30~100ul（根据细胞的多少决定）, 振荡混匀，室温避光20-30分钟。5•溶血：细胞浆和核抗原1•准备所需的管，并在管上标记上欲加入的抗体，其中一管是同型对照。2.首先每管中加入标本（骨髓或外周血）100ul（根据细胞的多少决定）,5UICD45-PC5抗体。室温避光20分钟。3.每管中加入固定液lOOul,剧烈振荡混匀，室温避光15分钟。4.各管中加入PBS4ml05.300g离心5分钟后,弃去上清液,振荡混匀。（1500r/min*5min）6.各管中加入透膜剂lOOul,轻轻混匀，室温避光5分钟。7.加抗体，阴性对照管中加入10ul,其余各管加入相应抗体各10ul,室温避光15分钟。8.各管中加入4mlPBS,振荡混匀。9.300g离心5分钟后，奔去上清液。10.各管中加入PBS500ul,振荡混匀。11.上机测样报告结果：报告百分数参考值CD34+<5%MPO+<5%粒系<20%淋系<30%临床意义 用于血液病的诊断和分型诊断T细胞亚群细胞内因子IFN・丫/IL・4检测原理:直接免疫荧光法。肝素钠抗凝全血在PMA,lonomycin和Monensin存在下短期培养（辅助性T细胞通过细胞因子IFN-yJL-4的产生分为Thl、Th2两个亚群。淋巴细胞活化以后才分泌细胞因子，且迅速分泌到细胞外。因此，利用刺激剂PMA+lonomycin体外激活淋巴细胞，然后用蛋口转运抑制剂Monensin阻止细胞因子分泌到细胞外，使细胞因子在细胞内滞留到一定的量），然后进行细胞膜表面抗原和细胞内细胞因了染色，使用流式细胞仪对CD4+细胞内的IFN・Y和IL-4进行测定。试剂淋巴细胞培养体系（自配）成分：刺激素PMA、离子霉素、莫能霉素、小牛血清、1640液。单克隆抗体CD4—PC5、IL・4・PE、IFN・Y・FITC操作：细胞培养与染色取200ul抗凝血加入lOulCD4-PC5单抗，室温避光孵育30分钟，RPMII640洗涤一次,将细胞加入培养体系中，5%C0237°C孵育18小时,取出后以PBS洗一次。用专用细胞内因子试剂进行细胞固定、透膜。将细胞分成两管，英一为测定管加入抗人IL-4-PE和IFN・Y-FITC,另一管加入同 型对照，室温避光20分钟，PBS洗涤一次，待测。流式细胞仪测定打开流式细胞仪及氮激光光源（488nm）预热20min,同时仪器自动初始化；用标准荧光微球校正光路和流路，然后依次检测标本，每份标本检测50000以上细胞，在前向散射光(FS)和测向散射光(SSC)散点图中圈定淋巴细胞群，然后分析CD4阳性细胞中IL・4・PE和IFN・Y・FITC的表达。•淋巴细胞在FS/SSC散点图中位置，即A门内细胞；•A门内CD4阳性细胞，即B门内细胞；•BfJ内TH细胞亚群分布：1区数值-・Th1细胞(％)4区数值一Th2细胞(％)2区数值-・ThO细胞(％)报告结果:报告百分数正常参考值Thl(IFN-y)：17.39±5.52%Th2(IL-4)：1.50±0.44%ThO:0.51±0.26%临床意义淋巴细胞均分泌多种细胞因子：Thl细胞主要分泌IL-2,IL-12,IFN-Y和TNF-b/a等,Th2细胞主要分泌IL-4.IL-5.IL-6,IFN-丫为Thl最特异分泌的细胞因子，IL・4为Th2最特异分泌的细胞因子，所以可根据分泌的细胞因子来区分Thl与Th2。Thl为IFN・Y+,Th2为IL-4+o静息状态(人的正 常生理状态、即未受到任何刺激下ThO分化为Thl和Th2的能力非常弱，在外周血中仅含有极少量的Thl和Th2细胞，这时我们所能检测的胞内的IFN・丫和IL-4也微乎其微。当Th细胞受到外界因素，如刺激素、病原体等刺激，其中ThO即会向Thl或Th2大量分化，此时我们检测到的IFN・Y和IL-4也较多。本实验的检测实际上是检测Th细胞对刺激素刺激的反应能力。