Talos电镜基本操作流程(SerialEM版) 11页

Talos电镜低温样品检查基本操作流程（SerialEM版）一、预检1.开启Col.Valves上样完成后，待电镜Column值低于20Log后打开低温样品杆shutter，待Column值低于10Log后开启Col.Valves。开启后：2.低倍检查样品放下荧光屏，把放大倍数调至100X左右，低倍下检查载网支持膜的完整度、冰层厚度、是否有严重污染等情况，将合适的网孔移动到荧光屏上小圈位置，并在Stages界面选择并记录下适宜进行数据收集的网孔位置。 3.自动聚焦与成像使用FEILowdose或者SerialEMLowdosemode（注：两者只能选其一，不可同时开启）进行聚焦与高倍成像，具体步骤如下（此处主要介绍SerialEMLowdosemode）：选择目标网孔，并将Stage移动到该位置，开启SerialEM（确认TIA已经处于开启状态），勾选Lowdosemode（1）。（1）（3）（6）（2）（5）（4）放下电镜荧光屏，依次选择图中Areatoshowwhenscreendown（2）中的Vie.，Foc.，Tri.，Rec.，查看放大倍数，doserate是否符合实际要求。其中，LowDoseMode下的文本显示当前成像模式下的实际状态参数（3）。2View模式为低倍（2000-4000倍即可），低剂量（<0.1e/Å/sec），用于搜索拍照位点。Record模式是真正的数据收集模式，按照所需的pixelsize选取适当的放大倍数（确定数据收集放大倍数后，按下控制面板中EucentricFocus使Objlens值到85.6750%（Talos）或者79.6164%（Titan）），然后再根据具体的剂量要求通过电镜面板上的intensity旋钮，调整到合适的doserate（如剂量调整范围不能满足要求，可以结合调整Spotsize实现）。focus模式是SerialEM的聚焦模式，通常设置和Record模式倍数相同（4），光斑大小可以在充分覆盖相机的前提下适当缩小。Trial模式是光斑自动居中模式，设置与focus模式一致即可。也可通过勾选KeepFocusandTrialidentical选项（5）自动将Trial模式和focus模式设置成一致。当修改了放大倍数或者intensity时，需要勾选continuousupdatamag&beam（6），来更新状态，然后再取消勾选continuousupdatamag&beam来保护当前状态不被修改。以上设置完成后，在SerialEM中Camera&MacroControls面板中点击View，获得一张View模式下的图片。 获得低倍图片右键拖拽该图片，使目标区域位于红十字叉中心，即可定位到该区域（为了便于聚焦，该步骤最好定位在碳膜上）。定位完成后，点击View刷新当前界面，确认目标区域定位正确（位于红十字叉中心），然后点击Z_focus运行自动聚焦Macro，完成后，样品成像区域将位于正焦点，之后可通过调整Z轴高度使之达到目标欠焦值（最好不要使用“defocus”钮，这可能会造成后期数据收集不在EucentricFocus上进行）。欠焦值设定完成后，点击view回到低倍模式，右键拖拽到成像区域，点击Camera&MacroControls面板中Record成像即可。4.自动数据收集如要进行自动数据收集，详情参见《利用SerialEM进行单颗粒数据收集的流程》 二、合轴（本步骤不建议普通用户自行操作，如需请联系电镜管理员）（进行此步骤操作前，请确保已经点击控制面板中EucentricFocus使Objlens值到85.6750%（Talos），并使用SerialEM的Z_focus自动聚焦至正焦）选择Areatoshowwhenscreendown中的Rec.（数据收集模式），放下荧光屏（照明区域最好为碳膜上），调出Apertures取消物镜光阑（Objective：[none]），退出SerialEM中的Lowdosemode：调出DirectAlignments，开始电镜合轴相关操作：1.GunShift：39合轴点中DirectAlignments下GunShift，将spotsize选定在3，缩小光斑到最小，使用控制面板上多功能按钮XY将光斑居中（如下图所示）：将spotsize选定在9，使用控制面板上样品台滚轮将光斑居中（如下图所示）： 如此反复调整，直至Spotsize在3、9之间转换时，光斑始终在屏幕最中央即可。调整完成后，点击Done，完成GunShift操作。点击Done：2.BeamtiltppX&BeamtiltppY点击BeamtiltppX（Y），将光斑缩小到合适大小，MFX将变为PivptbmtiltX（Y）： 查看Beamtilt过程中光斑是否存在偏移量，若有（如下左图），则通过调整MFX和MFY消除该偏移量（如下右图所示）。调整完成后，点击DirectAlignments下方Done。3.Beamshift(Tomobeamshift)点击Beamshift（若进行Tomo数据收集，则此处选择Tomobeamshift），将光斑缩小至最小，观察光斑是否居中，若否（如下图左），则通过调整MFX和MFY将光斑居中。调整完成后，点击DirectAlignments下方Done。 4.Rotationcenter(TomoRotationcenter)点击Rotationcenter（若进行Tomo数据收集，则此处选择TomoRotationcenter），将光斑调整到合适大小，移动Stage，使得视野正中央有明显目标物，观察光斑转动过程中，目标物图像是否只存在大小缩放，没有位置平移，若否，则通过调整MFX进行调节，直至目标物图像只在原位大小缩放为止。调整完成后，点击DirectAlignments下方Done。5.Coma-freePivotPointX（Y）点击Coma-freePivotPointX（Y）：缩小光斑到合适大小，观察光斑是否存在偏移量，若有（如下左图），则通过调整MFX和MFY消除该偏移量（如下右图所示）。调整完成后，点击DirectAlignments下方Done。 6.Coma-freeAlignmentX(Y)将光斑扩大到覆盖整个相机成像区域，抬起荧光屏，调出CCD/TVCamera面板，设定Integrationtime到0.25s，Sampling：2，点击Preview以及LiveFFT，调出TIA界面：点击Coma-freeAlignmentX（Y）：观察两个交替变化的成像状态下椭球形傅里叶环的长轴是否有变化，若有（如下图组所示）： （状态一）（状态二）则需通过调节MFX使得两个交替变化的成像状态下椭球形傅里叶环的长轴基本相同。调整完成后，点击DirectAlignments下方Done。 三、消象散放下荧光屏，将光斑扩大到覆盖整个荧光屏，调出Apertures，根据实际需要插入物镜光阑：点击控制面板上Diffraction进入衍射模式，如下图所示：观察光阑与光斑是否同心，若否（见上图），点击物镜光阑右侧Adjust，通过MFX和MFY将光阑与光斑调整到同心（见下图）。调整完成后，再次点击Adjust结束本次调整。 以上步骤调整完成后，再次点击控制面板上Diffraction退出衍射模式，将光斑扩大到覆盖整个相机成像区域，抬起荧光屏，调出CCD/TVCamera面板，设定Integrationtime到2s，Sampling：1，点击Preview以及LiveFFT，调出TIA界面，观察FFT环是否有为正圆形：若否，调出Stigmator，点击Condenser（或者Objective），使用MFX和MFY调整到FFT环呈现正圆形（如上图所示）。调整完成后点击None，结束本次调整。